Periodisk motströmskromatografi
Periodisk motströmskromatografi (PCC) är en metod för att köra affinitetskromatografi på ett kvasi-kontinuerligt sätt. Idag används processen främst för rening av antikroppar inom den biofarmaceutiska industrin samt inom forskning och utveckling. Vid rening av antikroppar protein A som affinitetsmatris. Emellertid kan periodiska motströmsprocesser tillämpas på vilken som helst kromatografi av affinitetstyp.
Grundläggande princip
I konventionell affinitetskromatografi laddas en enda kromatografikolonn med matarmaterial upp till den punkt innan målmaterialet (produkten) inte längre kan kvarhållas av affinitetsmaterialet. Hartset med den adsorberade produkten på tvättas sedan för att avlägsna föroreningar. Slutligen elueras den rena produkten med en annan buffert. Noterbart, om för mycket matningsmaterial laddas på kolonnen, kan produkten bryta igenom och produkten går följaktligen förlorad. Därför är det mycket viktigt att endast delvis belasta kolonnen för att maximera utbytet.
Periodisk motströmskromatografi lägger detta problem åt sidan genom att använda mer än en kolonn. PCC-processer kan köras med valfritt antal kolumner, från två. Följande stycke kommer att förklara en version av PCC med två kolumner, men andra protokoll med fler kolumner bygger på samma principer (se nedan). Ett diagram som visar de enskilda processtegen visas till höger. I steg 1, den så kallade sekventiella laddningsfasen, är kolumnerna 1 och 2 sammankopplade. Kolumn 1 är helt laddad med prov (röd) medan dess genombrott fångas på kolumn 2. I steg 2 tvättas kolumn 1, elueras, rengörs och återutjämnas medan laddningen separat fortsätter på kolumn 2. I steg 3, efter regenerering av kolumn 1 är kolumnerna åter sammankopplade och kolumn 2 är fulladdad medan dess genombrott fångas på kolumn 1. Slutligen, i steg 4 tvättas kolumn 2, elueras, rengörs och återutjämnas medan laddningen fortsätter oberoende av kolumn 1. Denna cykliska process upprepas på ett kontinuerligt sätt.
Det finns flera varianter av periodisk motströmskromatografi med mer än två kolonner. I dessa fall placeras ytterligare kolonner antingen i matningsströmmen under laddning, vilket har samma effekt som att använda längre kolonner. Alternativt kan ytterligare kolumner hållas i ett ledigt beredskapsläge under lastning. Detta läge ger ytterligare garantier för att huvudprocessen inte påverkas av tvätt- och rengöringsprotokoll, även om det i praktiken sällan krävs. Å andra sidan minskar de underutnyttjade kolonnerna den teoretiska maximala produktiviteten för sådana processer. Generellt är fördelarna och nackdelarna med olika flerkolumnsprotokoll föremål för debatt. Men utan tvekan, jämfört med enkolonnsatsprocesser, ger periodiska motströmsprocesser avsevärt ökad produktivitet.
Dynamisk processtyrning
På tidsskalan för kontinuerliga kromatografikörningar är det ganska vanligt att observera förändringar i viktiga processparametrar, såsom kolonnhälsa, buffertkvalitet, fodertiter (koncentration) eller fodersammansättning. Sådana förändringar resulterar i en förändrad maximal kolonnkapacitet, i förhållande till mängden laddat matarmaterial. För att uppnå en jämn kvalitet och avkastning för varje processcykel måste därför tidpunkten för de enskilda processtegen anpassas. Manuella förändringar är i princip tänkbara, men ganska opraktiska. Vanligare är att dynamiska processtyrningsalgoritmer övervakar processparametrarna och tillämpar ändringar efter behov automatiskt.
Det finns två olika driftlägen för dynamiska processregulatorer som används idag (se bild till höger). Den första, som kallas DeltaUV, övervakar skillnaden mellan två signaler från detektorer placerade före och efter den första kolumnen. Under den första laddningen är det stor skillnad mellan de två signalerna, men den minskar när föroreningarna tar sig igenom kolonnen. När kolonnen är helt mättad med föroreningar och endast ytterligare produkt hålls tillbaka, når skillnaden mellan signalerna ett konstant värde. Så länge produkten fångas helt på kolonnen kommer skillnaden mellan signalerna att förbli konstant. Så snart en del av produkten bryter igenom kolonnen (jämför ovan) minskar skillnaden. Sålunda kan tidpunkten och mängden av produktgenombrott bestämmas. Den andra möjligheten, kallad AutomAb, kräver endast signalen från en enda detektor bakom den första kolumnen. Vid initial laddning ökar signalen, eftersom fler och fler föroreningar tar sig igenom kolonnen. När kolonnen är mättad med föroreningar och så länge produkten är helt uppfångad på kolonnen, förblir signalen konstant. Så snart en del av produkten bryter igenom kolonnen (jämför ovan) ökar signalen igen. Sålunda kan tidpunkten och mängden av produktgenombrott åter bestämmas.
Båda iterationerna fungerar lika bra i teorin. I praktiken gör kravet på två synkroniserade signaler och exponeringen av en detektor för orenat fodermaterial, DetaUV-metoden mindre tillförlitlig än AutomAb.
Kommersiell situation
Från och med 2017 har GE Healthcare patent kring periodisk motströmskromatografi med tre kolumner: denna teknik används i deras Äkta PCC- instrument. [ citat behövs ] På samma sätt har ChromaCon patent för en optimerad version med två kolumner (CaptureSMB). [ citat behövs ] CaptureSMB används i ChromaCons Contichrom CUBE och under licens i YMC :s Ecoprime Twin- system. Ytterligare tillverkare av system som kan periodisk motströmskromatografi inkluderar Novasep och Pall . [ citat behövs ]