Phi X 174
|
|
| Escherichia virus ΦX174 | |
|---|---|
| Elektronmikrofotografi av fag ΦX174 | |
| Virusklassificering | |
| (orankad): | Virus |
| Rike : | Monodnaviria |
| Rike: | Sangervirae |
| Provins: | Phixviricota |
| Klass: | Malgrandaviricetes |
| Beställa: | Petitvirales |
| Familj: | Microviridae |
| Släkte: | Sinsheimervirus |
| Arter: |
Escherichia-virus ΦX174
|
phi X 174 (eller ΦX174 ) bakteriofagen är ett enkelsträngat DNA ( ssDNA ) virus som infekterar Escherichia coli och det första DNA-baserade genomet som ska sekvenseras. Detta arbete slutfördes av Fred Sanger och hans team 1977. 1962 hade Walter Fiers och Robert Sinsheimer redan visat den fysiska, kovalent slutna cirkulariteten hos ΦX174 DNA. Nobelpristagaren Arthur Kornberg använde ΦX174 som modell för att först bevisa att DNA syntetiserat i ett provrör av renade enzymer kunde producera alla egenskaper hos ett naturligt virus, vilket inledde den syntetiska biologins tidsålder . 1972–1974 Jerard Hurwitz , Sue Wickner och Reed Wickner tillsammans med medarbetare de gener som krävs för att producera enzymerna för att katalysera omvandlingen av den enkelsträngade formen av viruset till den dubbelsträngade replikativa formen. År 2003 rapporterades det av Craig Venters grupp att genomet av ΦX174 var det första som var fullständigt sammansatt in vitro från syntetiserade oligonukleotider. Viruspartikeln ΦX174 har också framgångsrikt sammansatts in vitro . 2012 visades det hur dess mycket överlappande genom kan dekomprimeras helt och fortfarande förbli funktionellt.
Genom
Denna bakteriofag har ett [+]-sens cirkulärt enkelsträngat DNA - genom på 5 386 nukleotider . Genomets GC-innehåll är 44 % och 95 % av nukleotiderna tillhör kodande gener. På grund av genomets balansbasmönster används det som kontroll-DNA för Illumina-sekvenserare. [ citat behövs ]
Gener
ΦX174 kodar för 11 gener, namngivna som på varandra följande bokstäver i alfabetet i den ordning de upptäcktes, med undantag för A* som är ett alternativt startkodon inom de stora A-generna. Endast generna A* och K anses vara icke-essentiella, även om det råder viss tvekan om A* eftersom dess startkodon kan ändras till ATT men inte någon annan sekvens. Det är nu känt att ATT fortfarande sannolikt kan producera protein i E. coli och därför kan denna gen i själva verket vara väsentlig.
Den första hälften av ΦX174-genomet har höga nivåer av genöverlappning med åtta av 11 gener som överlappar med minst en nukleotid. Dessa överlappningar har visat sig vara icke-essentiella även om den refaktorerade fagen med alla genöverlappningar borttagna hade minskad kondition från vildtyp.
Phage ΦX174 har använts för att försöka fastställa frånvaron av oupptäckt genetisk information genom en "bevis genom syntes"-metoden.
Transkriptom
År 2020 genererades transkriptomet av ΦX174. Anmärkningsvärda egenskaper hos ΦX174-transkriptomet är en serie med upp till fyra relativt svaga promotorer i serie med upp till fyra Rho-oberoende (inneboende) terminatorer och en Rho-beroende terminator. [ citat behövs ]
Proteiner
ΦX174 kodar för 11 proteiner .
| Protein | Kopior | Fungera |
|---|---|---|
| A | — | Nicks RF DNA för att initiera rullande cirkelreplikation ; ligerar ändarna av linjär fag-DNA för att bilda enkelsträngat cirkulärt DNA |
| A* | — | Hämmar värdcells DNA-replikation; blockerar superinfekterande fag; inte nödvändigt |
| B | 60 i procapsid | Internt ställningsprotein involverat i prokapsidmontering |
| C | — | DNA-förpackning |
| D | 240 i procapsid | Externt ställningsprotein involverat i prokapsidmontering |
| E | — | Värdcellslys _ |
| F | 60 i virion | Huvudsakligt kapsidprotein |
| G | 60 i virion | Stort spikeprotein |
| H | 12 i virion | DNA-pilotprotein (eller mindre spikprotein) |
| J | 60 i virion | Binder till nytt enkelsträngat fag-DNA; åtföljer fag-DNA till prokapsid |
| K | — | Optimerar burststorlek; inte nödvändigt |
Proteom
Identifiering av alla ΦX174-proteiner med hjälp av masspektrometri har nyligen rapporterats.
Infektionscykel
Infektion börjar när G-protein binder till lipopolysackarider på den bakteriella värdcellytan. H-protein (eller DNA-pilotproteinet) styr det virala genomet genom bakteriemembranet hos E.coli -bakterier, troligen via en förutspådd N-terminal transmembrandomänspiral . Det har emellertid blivit uppenbart att H-protein är ett multifunktionellt protein. Detta är det enda virala kapsidproteinet i ΦX174 som saknar kristallstruktur av ett par anledningar. Den har låg aromatisk halt och hög glycinhalt , vilket gör proteinstrukturen mycket flexibel och dessutom är enskilda väteatomer (R-gruppen för glyciner) svåra att upptäcka i proteinkristallografi. Dessutom inducerar H-protein lys av bakterievärden vid höga koncentrationer eftersom den förutsagda N-terminala transmembranspiralen lätt sticker hål genom bakterieväggen. Genom bioinformatik innehåller detta protein fyra förutsagda coiled-coil- domäner som har en signifikant homologi med kända transkriptionsfaktorer. Dessutom fastställdes det att de novo H-protein krävdes för optimal syntes av andra virala proteiner. Mutationer i H-protein som förhindrar inkorporering av viral kan övervinnas när överskottsmängder av protein B, det interna ställningsproteinet, tillförs. [ citat behövs ]
DNA:t kastas ut genom en hydrofil kanal vid den 5-faldiga vertexen. Det är underförstått att H-protein finns i detta område men experimentella bevis har inte verifierat dess exakta placering. Väl inne i värdbakterien fortsätter replikeringen av [+] ssDNA-genomet via negativ sens DNA-mellanprodukt. Detta görs eftersom faggenomets superspolar och den sekundära strukturen som bildas av sådan supercoiling attraherar ett primosomproteinkomplex . Detta translokerar en gång runt genomet och syntetiserar ett [−]ssDNA från det positiva ursprungliga genomet. [+]ssDNA-genom för att paketeras till virus skapas från detta genom en rullande cirkelmekanism. Detta är mekanismen genom vilken det dubbelsträngade supercoiled genomet hackas på den positiva strängen av ett viruskodat A-protein, vilket också attraherar ett bakteriellt DNA-polymeras (DNAP) till klyvningsstället. DNAP använder den negativa strängen som en mall för att ge positiv känsla för DNA. När det translokerar runt genomet förskjuter det den yttre strängen av redan syntetiserat DNA, som omedelbart beläggs av SSBP -proteiner. A-proteinet klyver hela genomet varje gång det känner igen ursprungssekvensen. [ citat behövs ]
Eftersom D-protein är det vanligaste gentranskriptet är det det mest protein i den virala prokapsiden. På liknande sätt är gentranskript för F, J och G rikligare än för H eftersom stökiometrin för dessa strukturella proteiner är 5:5:5:1. Primosomerna är proteinkomplex som fäster/binder enzymet helikas på mallen. Primosomer ger RNA-primrar för DNA-syntes till strängar. [ citat behövs ]
Fylogenetik och mångfald
ΦX174 är nära besläktad med andra mikroviridae , särskilt NC-fagen (t.ex. NC1, NC7, NC11, NC16, NC37, NC5, NC41, NC56, NC51, etc.) och mer avlägset besläktad med de G4-liknande fagerna och ännu mer avlägset besläktade till den a3-liknande fagen. Rokyta et al. 2006 presenterade ett fylogenetiskt träd över deras relationer.
Används
Experimentell evolution
ΦX174 har använts som modellorganism i många evolutionsexperiment.
Bioteknik
ΦX174 används regelbundet som en positiv kontroll vid DNA-sekvensering på grund av dess relativt lilla genomstorlek i jämförelse med andra organismer, dess relativt balanserade nukleotidinnehåll — cirka 23 % G, 22 % C, 24 % A och 31 % T, dvs. 45 % G+C och 55 % A+T, se accessionen NC_001422.1 för dess 5 386 nukleotider långa sekvens. Illuminas sekvenseringsinstrument använder ΦX174 som en positiv kontroll, och en enda Illumina-sekvenseringskörning kan täcka ΦX174-genomet flera miljoner gånger om, vilket med stor sannolikhet gör detta till det mest sekvenserade genomet i historien. [ citat behövs ]
ΦX174 används också för att testa motståndskraften hos personlig skyddsutrustning mot blodburna virus.
ΦX174 har också modifierats för att möjliggöra peptidvisning (fagvisning) från det virala kapsid-G-proteinet.
Syntetisk biologi
ΦX174-genomet var den första fagen som klonades i jäst, vilket ger en bekväm torrdocka för genommodifieringar. ΦX174 var också det första genomet som var helt dekomprimerat, med alla genöverlappningar borttagna. Effekten av dessa förändringar resulterade i signifikant minskad värdbindning, proteinuttrycksstörning och värmekänslighet.
Se även
externa länkar
- Goodsell D (februari 2000). "Bakteriofag phiX174" . Månadens molekyl . RCSB-PDB.