Nukleinsyrakvantifiering

Optisk densitet av ribosomprov. De viktiga våglängderna 260nm och 280nm är märkta.

Inom molekylärbiologin utförs vanligen kvantifiering av nukleinsyror för att bestämma de genomsnittliga koncentrationerna av DNA eller RNA som finns i en blandning, såväl som deras renhet. Reaktioner som använder nukleinsyror kräver ofta speciella mängder och renhet för optimal prestanda. Hittills finns det två huvudsakliga metoder som används av forskare för att kvantifiera, eller fastställa koncentrationen, av nukleinsyror (som DNA eller RNA) i en lösning. Dessa är spektrofotometrisk kvantifiering och UV-fluorescensmärkning i närvaro av ett DNA-färgämne. ^{[ citat behövs ]}

Spektrofotometrisk analys

En av de vanligaste metoderna för att kvantifiera DNA eller RNA är användningen av spektrofotometrisk analys med en spektrofotometer . En spektrofotometer kan bestämma de genomsnittliga koncentrationerna av nukleinsyror DNA eller RNA som finns i en blandning, såväl som deras renhet.

Spektrofotometrisk analys bygger på principerna att nukleinsyror absorberar ultraviolett ljus i ett specifikt mönster. När det gäller DNA och RNA utsätts ett prov för ultraviolett ljus vid en våglängd av 260 nanometer (nm) och en fotodetektor mäter ljuset som passerar genom provet. En del av det ultravioletta ljuset kommer att passera igenom och en del kommer att absorberas av DNA/RNA. Ju mer ljus som absorberas av provet, desto högre nukleinsyrakoncentration i provet. Den resulterande effekten är att mindre ljus kommer att träffa fotodetektorn och detta ger en högre optisk densitet (OD)

Med Beer-Lambert-lagen är det möjligt att relatera mängden ljus som absorberas till koncentrationen av den absorberande molekylen. Vid en våglängd på 260 nm är den genomsnittliga extinktionskoefficienten för dubbelsträngat DNA 0,020 (μg/ml) ⁻¹ cm ⁻¹ , för enkelsträngat DNA är det 0,027 (μg/ml) ⁻¹ cm ⁻¹ , för singel. -strängat RNA är det 0,025 (μg/ml) ^-1 cm ^-1 och för korta enkelsträngade oligonukleotider är det beroende av längden och bassammansättningen. Således motsvarar en Absorbans (A) på 1 en koncentration på 50 μg/ml för dubbelsträngat DNA. Denna beräkningsmetod är giltig för upp till ett A på minst 2. En mer exakt extinktionskoefficient kan behövas för oligonukleotider; dessa kan förutsägas med hjälp av närmaste granne-modellen.

Beräkningar

Den optiska densiteten genereras från ekvationen:

Optisk densitet= Log (Intensitet av infallande ljus / Intensitet av transmitterat ljus)

Rent praktiskt bör ett prov som inte innehåller något DNA eller RNA inte absorbera något av det ultravioletta ljuset och därför producera en OD på 0

Optisk densitet= Log (100/100)=0

När man använder spektrofotometrisk analys för att bestämma koncentrationen av DNA eller RNA, används Beer-Lambert-lagen för att bestämma okända koncentrationer utan behov av standardkurvor. I huvudsak gör Beer Lambert-lagen det möjligt att relatera mängden ljus som absorberas till koncentrationen av den absorberande molekylen. Följande absorbansenheter till omvandlingsfaktorer för nukleinsyrakoncentration används för att omvandla OD till koncentration av okända nukleinsyraprover:

A260 dsDNA = 50 µg/ml

A260 ssDNA = 33 µg/ml

A260 ssRNA = 40 µg/ml

Omvandlingsfaktorer

När du använder en banlängd på 10 mm , multiplicera helt enkelt OD med omvandlingsfaktorn för att bestämma koncentrationen. Exempel, ett 2,0 OD dsDNA-prov motsvarar ett prov med en koncentration på 100 µg/ml.

När du använder en banlängd som är kortare än 10 mm, kommer den resulterande OD att reduceras med en faktor 10/banalängd. Med exemplet ovan med en 3 mm banlängd skulle OD för provet på 100 µg/ml reduceras till 0,6. För att normalisera koncentrationen till en ekvivalent på 10 mm görs följande:

0,6 OD X (10/3) * 50 µg/ml=100 µg/ml

De flesta spektrofotometrar tillåter val av nukleinsyratyp och väglängd så att den resulterande koncentrationen normaliseras till 10 mm väglängd som är baserad på principerna i Beers lag .

A260 som kvantitetsmätning

"A260-enheten" används som ett kvantitetsmått för nukleinsyror. En A260-enhet är mängden nukleinsyra som finns i 1 ml och som producerar en OD på 1. Samma omvandlingsfaktorer gäller, och därför, i sådana sammanhang:

1 A260-enhet dsDNA = 50 µg

1 A260-enhet ssDNA = 33 µg

1 A260-enhet ssRNA = 40 µg

Provrenhet (förhållanden 260:280 / 260:230)

Det är vanligt att nukleinsyraprover är kontaminerade med andra molekyler (dvs proteiner, organiska föreningar, annat). Den sekundära fördelen med att använda spektrofotometrisk analys för nukleinsyrakvantifiering är förmågan att bestämma provets renhet med hjälp av 260 nm:280 nm beräkningen. Förhållandet mellan absorbansen vid 260 och 280 nm (A260 _/280 ) används för att bedöma renheten hos nukleinsyror. För rent DNA anses A 260/280 allmänt vara ~1,8 men har argumenterats för att översättas - på grund av numeriska fel i originalet Warburg - till en blandning av 60% protein och 40% DNA _. Förhållandet för rent RNA A _260/280 är ~2,0. Dessa förhållanden används vanligtvis för att bedöma mängden proteinkontamination som finns kvar från nukleinsyraisoleringsprocessen eftersom proteiner absorberar vid 280 nm.

Förhållandet mellan absorbans vid 260 nm vs 280 nm används vanligtvis för att bedöma DNA-kontamination av proteinlösningar , eftersom proteiner (särskilt de aromatiska aminosyrorna) absorberar ljus vid 280 nm. Det omvända är dock inte sant - det krävs en relativt stor mängd proteinkontamination för att signifikant påverka förhållandet 260:280 i en nukleinsyralösning.

260:280 förhållande har hög känslighet för nukleinsyrakontamination i protein:

% protein	% nukleinsyra	260:280 förhållande
100	0	0,57
95	5	1,06
90	10	1,32
70	30	1,73

Förhållandet 260:280 saknar känslighet för proteinkontamination i nukleinsyror (tabellen visas för RNA, 100 % DNA är ungefär 1,8):

% nukleinsyra	% protein	260:280 förhållande
100	0	2.00
95	5	1,99
90	10	1,98
70	30	1,94

Denna skillnad beror på den mycket högre massförsvagningskoefficienten nukleinsyror har vid 260 nm och 280 nm, jämfört med proteiner. På grund av detta, även för relativt höga koncentrationer av protein, bidrar proteinet relativt lite till 260 och 280 absorbansen. Även om proteinkontaminationen inte kan bedömas på ett tillförlitligt sätt med ett förhållande på 260:280, betyder detta också att det bidrar med lite fel vid uppskattning av DNA-kvantitet.

Föroreningsidentifiering

Undersökning av provspektra kan vara användbart för att identifiera att det finns ett problem med provets renhet.

Tabell över potentiella föroreningsfaktorer
Förhållande	Låg läsning	Hög läsning
A260/A230	Överföring av kolhydrater (ofta ett problem med växter) Kvarvarande fenol från nukleinsyraextraktion Resterande guanidin (används ofta i kolonnbaserade kit) Glykogen används för utfällning.	Göra en blankmätning på en smutsig piedestal. Använder en olämplig lösning för blankmätningen. Blindlösningen bör ha samma pH och liknande jonstyrka som provlösningen. Exempel: att använda vatten för blankmätningen för prover lösta i TE kan resultera i låga 260/230-förhållanden.
A260/A280	Kvarvarande fenol eller annat reagens som är associerat med extraktionsprotokollet. En mycket låg koncentration (< 10 ng/μl) av nukleinsyra.	Resterande RNA från nukleinsyraextraktion. * Höga 260/280 renhetsförhållanden är normalt inte tecken på några problem.

Andra vanliga föroreningar

Kontaminering av fenol , som vanligen används vid nukleinsyrarening, kan avsevärt kasta bort kvantifieringsuppskattningar. Fenol absorberas med en topp vid 270 nm och en A _260/280 på 1,2. Nukleinsyraberedningar som inte är kontaminerade av fenol bör ha en A _260/280 på cirka 2. Kontaminering med fenol kan avsevärt bidra till överskattning av DNA-koncentrationen.
Absorption vid 230 nm kan orsakas av kontaminering av fenolatjoner , tiocyanater och andra organiska föreningar. För ett rent RNA-prov bör A _230:260:280 vara cirka 1:2:1, och för ett rent DNA-prov bör A _230:260:280 vara cirka 1:1,8:1.
Absorption vid 330 nm och högre indikerar att partiklar förorenar lösningen, vilket orsakar spridning av ljus i det synliga området. Värdet i ett rent nukleinsyraprov bör vara noll. ^{[ citat behövs ]}
Negativa värden kan uppstå om en felaktig lösning användes som blank. Alternativt kan dessa värden uppstå på grund av fluorescens av ett färgämne i lösningen.

Analys med fluorescerande färgämnesmärkning

En alternativ metod för att bedöma DNA- och RNA-koncentrationen är att märka provet med en fluorescerande tagg , som är ett fluorescerande färgämne som används för att mäta intensiteten hos färgämnena som binder till nukleinsyror och selektivt fluorescerar när de binds (t.ex. Etidiumbromid ). Denna metod är användbar för fall där koncentrationen är för låg för att exakt bedöma med spektrofotometri och i fall där föroreningar som absorberar vid 260 nm omöjliggör exakt kvantifiering med den metoden. Fördelen med fluorescenskvantifiering av DNA och RNA är den förbättrade känsligheten jämfört med spektrofotometrisk analys . Även om den ökade känsligheten kommer på bekostnad av ett högre pris per prov och en längre provberedningsprocess .

Det finns två huvudsakliga sätt att närma sig detta. "Spotting" innebär att ett prov placeras direkt på en agarosgel eller plastfolie . Det fluorescerande färgämnet finns antingen i agarosgelen eller tillsätts i lämpliga koncentrationer till proverna på plastfilmen. En uppsättning prover med kända koncentrationer är fläckiga bredvid provet. Koncentrationen av det okända provet uppskattas sedan genom jämförelse med fluorescensen av dessa kända koncentrationer. Alternativt kan man köra provet genom en agaros- eller polyakrylamidgel , tillsammans med några prover med känd koncentration. Liksom med punkttestet uppskattas koncentrationen genom jämförelse av fluorescensintensiteten med de kända proverna.

Om provvolymerna är tillräckligt stora för att använda mikroplattor eller kyvetter , kan de färgladdade proverna också kvantifieras med en fluorescensfotometer . Minsta provvolym börjar vid 0,3 μl

Hittills finns det ingen fluorescensmetod för att fastställa proteinkontamination av ett DNA-prov som liknar den 260 nm/280 nm spektrofotometriska versionen.

Se även

externa länkar