NS5B-hämmare

Sofosbuvir , den första nukleosidanaloghämmaren godkänd av FDA

strukturella protein 5B ( NS5B )-hämmare är en klass av direktverkande antivirala medel som ofta används vid behandling av kronisk hepatit C. Beroende på verkningsställe och kemisk sammansättning kan NS5B-hämmare kategoriseras i tre klasser - nukleosid aktiva ställe-hämmare (NI), icke-nukleosid allosteriska hämmare och pyrofosfatanaloger . Därefter underklassificeras alla tre klasserna. Alla hämmar RNA-syntes av NS5B men i olika stadier/ställen vilket resulterar i oförmåga till viral RNA-replikation . Uttryck av direktverkande NS5B-hämmare sker inte i celler som inte är infekterade av hepatit C-virus, vilket verkar vara fördelaktigt för denna klass av läkemedel.

Låg effekt, allvarliga biverkningar, utveckling av resistens för tidigare tillgängliga hepatit C-behandlingar var de största problemen innan utvecklingen av direktverkande antivirala medel, och förblev ett problem i början av deras utveckling. Därför var kombinationsdirektverkande antivirala terapier att föredra. Forskning har visat att specifika anti-hepatit C-virusmedel som NS5B-hämmare leder till förbättrad effekt och tolerabilitet.

Medicinsk användning

Hepatit C är en av de mest betydande sjukdomarna som drabbar människor, men trots dess globala inverkan finns det inga vacciner eller effektiva terapier utan stora biverkningar. Hepatit C-virusets icke-strukturella protein 5B ( NS5B ) har blivit ett favoritmål för utvecklingen av läkemedel mot hepatit C-virus, eftersom det inte uttrycks i celler som inte är infekterade av hepatit C-virus. Behandlingen för patienter med kronisk hepatit C som användes före utvecklingen av direktverkande antivirala medel var ribavirin plus pegylerat interferon alfa-2a . Denna behandling var otillfredsställande i många fall, både på grund av bristande effekt och på grund av biverkningar.

Sofosbuvir , en mycket potent hämmare av NS5B-polymeraset, är aktiv i alla genotyper av hepatit C-virus. Det har hög effekt i kombination med flera andra läkemedel, som ledipasvir , antingen med eller utan peginterferon-alfa . Det har många fördelar på grund av dess tolerabilitet, höga styrka, hög motståndsbarriär, låga biverkningar och oral administrering. En annan fördel med sofosbuvir är den låga frekvensen av interaktioner med andra läkemedel, eftersom dess metabolism inte går genom CYP3A4 väg. Dess kostnad kan dock vara en utmaning, eftersom alla nya direktverkande antivirala läkemedel kan vara mycket dyra.

Skadliga effekter

Genom att jämföra det virologiska svaret av NS5B-hämmare med tidigare behandling av kronisk hepatit C med kombinationen av interferon och ribavirin , var det möjligt att observera en signifikant skillnad i effekt och säkerhet. Effektiviteten för interferon plus ribavirin varierade inom 44–46 % medan den ökar med upp till 90 % av direktverkande antivirala medel som NS5B-hämmare/ Data om frekvensen av biverkningar kan variera mellan forskningen för båda läkemedelskategorierna. Ändå finns det en signifikant skillnad mellan säkerhetsprofilerna för NS5B-hämmare, särskilt sofosbuvir och kombinationen av interferon och ribavirin. Om man jämför interferon-innehållande terapier, orsakar sofosbuvir inte neutropeni, trombocytopeni eller några andra allvarliga biverkningar. Vanliga biverkningar associerade med sofosbuvir är huvudvärk, trötthet, sömnlöshet, yrsel, klåda, infektioner i övre luftvägarna, utslag, ryggsmärtor, anemi och lymfopeni. Med tillkomsten av direktverkande antivirala medel har varaktigheten av hepatitbehandlingen också reducerats imponerande. Biverkningarnas svårighetsgrad är starkt förknippad med behandlingens varaktighet och den dos som används för hepatit C-behandling. Därför har direktverkande antivirala medel blivit den initiala behandlingen som används för de flesta patienter med kronisk hepatit C.

Hepatit C-virus

Hepatit C-virus tillhör familjen Flaviviridae och släktet hepavirus. Det är ett litet hölje, enkelsträngat RNA-virus med positiv polaritet. Ett lipiddubbelskikt som innehåller två virala glykoproteiner, El och E2, bildar höljet och virion.

Hepatit C-virus överförs genom exponering för infekterat blod eller kroppsvätskor, och den vanligaste vägen är genom injektion med infekterade nålar. I början av hepatit C-virusets livscykel binder virioner till specifika receptorer på hepatocyter. Viruset internaliseras och nukleokapsiden frisätts i hepatocytens cytoplasma efter bindning med receptorn. NS5B-proteinet, som är ett RNA-beroende RNA-polymeras , katalyserar hepatit C-virusreplikation.

Hepatit C-viruset kan orsaka akut infektion men de flesta patienter är asymtomatiska vid exponering. Ungefär en tredjedel av patienterna utvecklar symtom som trötthet, artralgi och gulsot. Cirka 15–45 % av patienterna med diagnosen akut infektion kan rensa ut viruset utan behandling. Efter akut infektion kommer de flesta infekterade patienter att utveckla kronisk infektion, vilket ökar risken för att senare utveckla livshotande tillstånd, såsom levercirros och hepatocellulärt karcinom.

Under 2015 levde cirka 71 miljoner individer över hela världen med kronisk hepatit C och det fanns 1,75 miljoner nya hepatit C-virusinfektioner samma år. Med högeffektiva direktverkande antivirala medel kan hepatit C botas inom 2 till 3 månader.

NS5B-receptor

NS5B är ett viralt protein som finns i hepatit C-viruset och är ett viktigt enzym i replikationsprocessen. Proteinet är ett RNA-beroende RNA-polymeras, vilket innebär att det använder enkelsträngat RNA ( ssRNA ) som mall för att bilda dubbelsträngat RNA ( dsRNA ). Den innehåller 591 aminosyror med de sista 21 aminosyrorna i den C-terminala änden som fungerar som ett cellmembranankare som är hydrofobt till sin natur. NS5B kategoriseras därför som ett membranprotein, betecknat som ett "svansförankrat protein".

Strukturen hos NS5B liknar andra virala polynukleotidpolymeraser och består av tre subdomäner. Strukturen liknar en högerhand med en palmdomän som fungerar som grunden för den aktiva platsen, en fingerdomän och en tumdomän. Tum- och fingerdomänerna omger enzymets aktiva plats.

Fingerdomänen har två slingor, benämnda Λ1 och Λ2, som når över och interagerar med toppen av tumdomänen för att omsluta den aktiva platsen. Dessa två slingor främjar NS5B för att bibehålla dess slutna konformation som är nödvändig för nukleinsyrabindning och för att krampa rörelsen av enzymet över RNA-mallförlängningsprocessen. NS5B har även allosteriska platser utöver den aktiva sidan. Palm I, domän nära det aktiva stället, palm II, delvis överlappande handflata I och mot det aktiva stället, tumme I, tumdomän nära fingertopparna och tumme II, tumdomänens yttre yta.

Handlingsmekanism

Det finns tre kända klasser av NS5B-hämmare: icke-nukleosidanaloghämmare, nukleosid/nukleotidanaloghämmare och pyrofosfatanaloger. Klasserna skiljer sig åt i sin struktur och var de binder till NS5B-proteinet: vid allosteriska bindningsställen, enzymets aktiva plats respektive pyrofosfatbindningsstället.

Nukleosidanaloghämmare

Nukleosidanaloghämmare avslutar RNA-syntesen som är nödvändig för RNA-replikation. De gör det genom att inkorporeras av det RNA-beroende RNA-polymeraset, vilket förhindrar att inkommande nukleotider läggs till RNA-kedjan. Det har föreslagits att steriskt hinder av nukleosidhämmarna, som innehåller en 3'-hydroxylgrupp, är orsaken till kedjeavbrottet. På grund av denna mekanism kallas nukleosidhämmare ibland kedjeavslutande inhibitorer. Nukleosidhämmare av hepatit C-virus utvecklas som prodrugs och spjälkas så småningom vid deras verkningsställe i levern av leverenzymer och går igenom fosforylering till en trifosfatform för att bli aktiva för att rikta polymeraset mot dess mycket konserverade aktiva ställe.

Icke-nukleosidanaloghämmare

Icke-nukleosidanaloghämmare är en mångsidig klass av NS5B-hämmare. De kan ordnas i tre kategorier baserat på deras bindningsställen: inhibitorer av det aktiva stället, hämmare av det allosteriska stället och hämmare av olika ställen. Inhibitorerna för diverse ställen är de hämmare som ännu inte har ett definierat bindningsställe. Från och med 2015 har fem olika allosteriska bindningsställen upptäckts för de icke-nukleosidanaloga hämmarna av hepatit C-virus. Två av dem är belägna vid polymerasets tumdomän och de andra tre i handflatans domän. De icke-nukleosidanaloga hämmarna hämmar polymerasaktiviteten på olika sätt, vilket beror på det allosteriska ställe till vilket hämmaren binder. I motsats till nukleosidanalogerna, konkurrerar icke-nukleosidanaloghämmare inte med nukleotider eller RNA-mallen. Istället, genom att binda till RNA-beroende RNA-polymeras, hämmar de polymerasaktivitet genom att hämma konformationsförändringar som är nödvändiga för NS5B-aktivitet.

Pyrofosfatanaloghämmare

Pyrofosfatanaloghämmare efterliknar det oorganiska pyrofosfatet . Under nukleotidyl-överföringsreaktionen, en enzymatisk reaktion som är grundläggande för DNA-syntes, frisätts pyrofosfat, som binder till vissa bindningsställen vid NS5B-polymeraset. Detta bindningsställe är också bindningsstället för β- och 𝛾-fosfat av nukleotidtrifosfater som läggs till RNA-kedjan i den pågående RNA-replikationen.

Pyrofosfaterna är en nödvändig komponent av nukleotidinkorporeringen i RNA-replikationen. Pyrofosfatinhibitorer binder till polymerasets aktiva ställe i konkurrens både med nukleotiderna och pyrofosfatet, vilket resulterar i en nukleofil attack på den terminala fosfodiesterbindningen av det nyligen frisatta pyrofosfatet och därigenom stoppar RNA- replikationen .

Läkemedelsupptäckt och utveckling

Upptäckt

NS5B-kristallstrukturen rapporterades första gången i litteraturen av tre olika forskargrupper 1999. Därefter eftersträvades det NS5B RNA-beroende RNA-polymeraset som ett mål för utvecklingen av behandlingar för hepatit C. Med kristalliserade röntgenstrukturer, hög genomströmning screening , enzym- och cellbaserade replikonanalyser och djurmodeller för screening upptäcktes många potentiella läkemedelskandidater men få har godkänts.

Utveckling

Många strukturellt olika föreningar hämmar NS5B-polymeras vid olika bindningsställen, men relativt få kandidater uppfyller kraven på selektivitet, acceptabel pK och toxicitetsprofiler. Direktverkande antivirala medel var ett viktigt framsteg i behandlingen av kronisk hepatit C. I december 2013 godkändes sofosbuvir av FDA och i oktober 2014 godkändes ledipasvir och sofosbuvir i en kombinationstablett. Framstegen i utvecklingen av direktverkande antivirala medel har varit mycket snabba och det finns flera medel mot hepatit C-virus i kliniska prövningar.

Struktur–aktivitet relation

Nukleosidhämmare

Nukleosidhämmare av hepatit C-virus NS5B klassificeras i tre huvudklasser: purinnukleosid, inhibitorer, pyrimidinnukleosidinhibitorer och diverse nukleosidhämmare. Sofosbuvir är en pyrimidinnukleosidanalog och en fosforamiditprodrug.

Pyrimidinnukleosidhämmare

Den isomera formen av aminosyran har betydelse eftersom D -alaninderivatet är inaktivt vilket innebär att den naturliga L -aminosyran krävs för aktivitet. När man observerar aminosyrasidokedjan (R1) _är en liten alkylgrupp en livskraftig substitution, men styrkan minskar avsevärt om substitutionen är större än etyl. Metyl har den största styrkan och är därför en gångbar substitution.

När aminosyran är alanin och fosfatestern är fenylsubstituent är grupperna vid karboxylsyraestern (R ₂ ) som ger den önskade submikromolära aktiviteten små alkylgrupper och grenade alkylgrupper, till exempel metyl, etyl, isopropyl, n- butyl och 2-butyl. Men cytotoxicitet observeras med n-butyl-, 2-butyl- och n-pentylestrar. Fenyl- och halogenerade alkylgrupper ger inte tillräckligt med styrka.

Vid utvärdering av fosforamidatestersubstituenten (R3) _har 1-naftylestern den största styrkan men den är också cytotoxisk så den är inte en livskraftig substituent. Mono- och dihalogenererade fenoliska estrar har också god styrka men de är också cytotoxiska. Ett derivat med fenol som substituent har god styrka och är inte cytotoxiskt. Cyklohexylesterderivaten gör störst skillnad i strukturaktivitetsförhållandet eftersom de visar så mycket som 10-faldig förbättring i styrka.

Tabell 1 : Struktur–aktivitetssamband för pyrimidinnukleosidhämmare

Förening	R 1	R 2	R 3	EC 90	Hämning av cellulärt rRNA replikering vid 50 µM (%)
1	Metyl	Metyl	Fenyl	1,62	0,0
2	Metyl	Isopropyl	Fenyl	0,52	25,9
3	Metyl	c-Hexyl	Fenyl	0,25	61.1
4	Metyl	Etyl	4-F-fenyl	0,76	55,3
5	Metyl	Isopropyl	4-F-fenyl	0,77	0,0
6	Metyl	Isopropyl	4-Cl-Fenyl	0,42	0,0
7	Metyl	c-Hexyl	4-F-fenyl	0,04	52.1

Icke-nukleosidhämmare

Baserat på olika bindningsställeegenskaper klassificeras icke-nukleosidhämmare av hepatit C-virus NS5B i tre distinkta kategorier: hämmare av det aktiva stället, hämmare av det allosteriska stället och diverse icke-nukleosidinhibitorer. För diverse icke-nukleosidanaloghämmare är bindningsstället antingen inte definierat eller under ytterligare utredning.

Hämmare av allosteriska ställen

Inhibitorer av allosteriska ställen är en stor grupp inom kategorin icke-nukleosid med minst 10 olika analoger som är kända. En av dessa allosteriska inhibitorer är N-bensoylpyrrolidin.

2005 identifierade GlaxoSmithKline N-bensoylpyrrolidin som en NS5B-hämmare genom screening med hög genomströmning. En isobutylanalog (tabell 2) visade IC50=0,7 μM submikromolär aktivitet mot NS5B. I utvecklingen ersattes 5-fenyl med olika heterocykler för att försöka optimera hämningen, föreningar (2-4). 2-pyridyl (4)-gruppen tolererades väl på pyrrolidinställningen, medan ersättning med 2-tienyl ledde till förening (5) med IC50 = 0,3 μM. För att få en hög grad av enantiospecificitet för enzym-inhibitorreaktionen, bestämdes en (+) enantiomer av (5) vara mer potent än dess (–) motsvarighet. Dessa föreningar binder alla till palmregionen av NS5B-polymeraset i en allosterisk ficka. Ytterligare utvecklingar gjordes av Burton G 2007 för att optimera acylpyrrolidinställningen för att uppnå replikonaktivitet. Genom att ersätta tiofen med tiazol i N-acylpyrrolidinställningen framställdes analog (6) för att uppnå stor enzymaktivitet, IC50=40nM. Icke desto mindre hade denna serie av föreningar låg cellulär permeabilitet. Den mest potenta analogen under optimeringen av cellulär aktivitet i denna serie var (7) med IC50 = 5nM och EC50 = 0,61 μM. Problemet med denna förening (7) var dålig oral biotillgänglighet och dålig absorption. För att uppnå en bättre farmakokinetisk profil ledde modifieringar av strukturen till förening (8) med EC50 på 0,39 μM och en oral biotillgänglighet på cirka 50 %. Denna förening valdes sedan ut som läkemedelskandidat för vidareutveckling som kombinationsterapi med peginterferon alfa-2a .

Tabell 2 : Effekten av strukturella förändringar av N-bensoylpyrrolidinstrukturen på hämmande aktivitet

Förening	R 1	R 2	R 3	R 4	NS5B IC 50 (µM)
1	–	–	–	–	0,7
2	COOH	2-tiazolyl	CF 3	H	0,4
3	COOH	2-furanyl	CF 3	H	0,8
4	COOH	2-pyridyl	CF 3	H	0,7
5	COOH	2-tienyl	CF 3	H	0,3
6	CONHSO 2 CH 3	2-tiazolyl	t-Bu	H	0,04
7	KONH 2	2-tiazolyl	t-Bu	OCH 3	0,005
8	CH 2 OCH 3	2-tiazolyl	t-Bu	OCH 3	0,44

Historia

Dynamisk utveckling av läkemedelsupptäckten startade i början av 1960-talet efter att hepatit A- och B-typerna upptäcktes. Många mediciner har testats i hopp om positiva resultat. Interferon var ett av de första som visade effektivitet. Därefter identifierades tre olika varianter av interferon alfa, beta och gamma.

1986 – Non-A, non-B hepatit identifierades som hepatit C, vilket var drivkraften för ytterligare forskning inom läkemedelsutveckling.

1990-talet – Dos och behandlingslängd med interferon fastställdes. Vid ungefär samma tidpunkt tillsattes ribavirin till interferonterapi, vilket överskred ett ihållande virologiskt svar på 50 %.

2001 – Pegylerat interferon godkändes. Pegylering av interferon ökade dess halveringstid samtidigt som ledde till en ökning av ihållande virologisk respons och minskad injektionsfrekvens.

På grund av den relativt låga effekten och tolerabiliteten av interferon och ribavirin genomfördes intensiva undersökningar av utvecklingen av direktverkande antivirala medel. Expression av direktverkande antivirala medel förekommer inte i oinfekterade celler, vilket förbättrar dess tolerabilitet och effektivitet i de flesta genotyper av hepatit C, upp till 90 %.

2011 – Det första direktverkande antivirala eller NS3/4A ( proteashämmare ) bocepreviret godkändes. Därefter godkändes andra hämmare i denna klass telaprevir, simeprevir, asunaprevir, paritaprevir och grazoprevir.

2013 – Den första NS5B-polymerashämmaren sofosbuvir godkänd. Dasabuvir godkändes 2014.

2014 – Den första NS5A-hämmaren ledipasvir godkändes. Fyra andra NS5A-hämmare av denna klass – daclatasvir, ombitasvir, elbasvir och velpatasvir – har därefter godkänts.

Alla direktverkande antivirala medel används som en del av kombinationsterapier som leder till bättre resultat än enstaka läkemedel vid behandling av kronisk hepatit C.