Lysbuffert
En lysbuffert är en buffertlösning som används för att bryta upp celler för användning i molekylärbiologiska experiment som analyserar de labila makromolekylerna i cellerna (t.ex. western blot för protein eller för DNA-extraktion ). De flesta lysbuffertar innehåller buffrande salter (t.ex. Tris -HCl ) och joniska salter (t.ex. NaCl ) för att reglera lysatets pH och osmolaritet . Ibland tillsätts tvättmedel (som Triton X-100 eller SDS ) för att bryta upp membranstrukturer. För lysbuffertar inriktade på proteinextraktion ingår ofta proteashämmare , och i svåra fall kan det nästan behövas. Lysbuffertar kan användas på både djur- och växtvävnadsceller.
Att välja en buffert
Det primära syftet med lyseringsbuffert är att isolera molekylerna av intresse och hålla dem i en stabil miljö. För proteiner, för vissa experiment, bör målproteinerna vara fullständigt denaturerade , medan i vissa andra experiment bör målproteinet förbli vikt och funktionellt. Olika proteiner har också olika egenskaper och finns i olika cellmiljöer. Därför är det viktigt att välja den bästa bufferten baserat på syftet och utformningen av experimenten. De viktiga faktorerna att beakta är: pH, jonstyrka, användning av tvättmedel, proteashämmare för att förhindra proteolytiska processer. Till exempel är tvättmedel nödvändig vid lysering av gramnegativa bakterier, men inte för grampositiva bakterier. Det är vanligt att en proteashämmare tillsätts till lysbufferten, tillsammans med andra valda enzymhämmare, såsom en fosfatasinhibitor när man studerar proteiner med fosforylering.
Komponenter
Buffert
Buffert skapar en miljö för isolerade proteiner. Varje buffertval har ett specifikt pH-intervall, så bufferten bör väljas baserat på om experimentets målprotein är stabilt under ett visst pH. För buffertar med liknande pH-intervall är det också viktigt att överväga om bufferten är kompatibel med experimentets målprotein. Tabellen nedan innehåller flera vanligast använda buffertar och deras pH-intervall.
| Buffert | pH-intervall |
|---|---|
| Natriumdivätefosfat / dinatriumvätefosfat | 5,8 - 8,0 |
| Tris - HCl | 7,0 - 9,0 |
| HEPES - NaOH | 7,2 - 8,2 |
Tillsatser
Salter
Lysbuffert innehåller vanligtvis ett eller flera salter. Funktionen av salter i lysbuffert är att fastställa en jonstyrka i buffertlösningen. Några av de mest använda salterna är NaCl, KCl och (NH 4 ) 2 SO 4. De används vanligtvis med en koncentration mellan 50 och 150 mM.
Rengöringsmedel
Detergenter är organiska amfipatiska (med hydrofob svans och ett hydrofilt huvud) tensider. De används för att separera membranproteiner från membran eftersom den hydrofoba delen av tvättmedlet kan omge biologiska membran och på så sätt isolera membranproteiner från membran. Även om tvättmedel används i stor utsträckning och har liknande funktioner, måste de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos tvättmedel av intresse beaktas i ljuset av målen för ett experiment.
Detergenter kategoriseras ofta som nonjoniska, anjoniska, katjoniska eller zwitterjoniska, baserat på deras hydrofila huvudgruppsdrag.
Nonjoniska detergenter som Triton X-100 och zwitterjoniska detergenter som CHAPS (3-[(3-kolamidopropyl)dimetylammonio]-1-propansulfonat) är icke-denaturerande (kommer inte att störa proteinfunktioner). Joniska rengöringsmedel som natriumdodecylsulfat (SDS) och katjoniska rengöringsmedel som etyltrimetylammoniumbromid är denaturerande (kommer att störa proteinfunktioner). Detergenter är en huvudingrediens som bestämmer lysstyrkan för en given lysbuffert.
Andra
Andra tillsatser inkluderar metalljoner, socker som glukos, glycerol, metallkelatorer (t.ex. EDTA ) och reduktionsmedel som ditiotreitol (DTT).
Vanligt använda buffertar
NP-40 lysbuffert
Det kan vara den mest använda lysbufferten. Solubiliseringsmedlet är NP-40 , som kan ersättas med andra tvättmedel i olika koncentrationer. Eftersom NP-40 är ett nonjoniskt rengöringsmedel har denna lysbuffert en mildare effekt än RIPA-buffert. Den kan användas när proteinfunktioner ska bibehållas med minimala störningar.
Recept:
- 150 mM NaCl
- 1,0 % Nonidet P-40 eller Triton X-100
- 50 mM Tris-Cl
- Justera pH till 7,4
RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) lysbuffert
RIPA-buffert är en vanligen använd lysbuffert för immunoutfällning och allmän proteinextraktion från celler och vävnader. Bufferten kan förvaras utan vanadat vid 4 °C i upp till 1 år. RIPA-buffert frisätter proteiner från celler samt stör de flesta svaga interaktioner mellan proteiner.
Recept:
- 1 % (vikt/vikt) Nonidet P-40 (NP-40)
- 1 % (vikt/volym) natriumdeoxicholat
- 0,1 % (vikt/volym) SDS
- 0,15 M NaCl
- 0,01 M natriumfosfat, pH 7,2
- 2 mM EDTA
- 50 mM natriumfluorid (NaF)
- 0,2 mM färskt natriumortovanadat (Na 3 VO 4 .2H 2 O, det har fosfatasinhibitorfunktion eftersom det härmar fosfat)
- 100 U/ml proteashämmare, såsom aprotinin
SDS (natriumdodecylsulfat) lysbuffert
SDS är joniskt denaturerande rengöringsmedel. Het SDS-buffert används ofta när proteinerna behöver solubiliseras fullständigt och denatureras.
Recept:
- 0,5 % (vikt/volym) SDS
- 0,05 M Tris⋅Cl
- Justera pH till 8,0
- Tillsätt 1 mM färsk ditiotreitol (DTT)
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) lyseringsbuffert
ACK används för lysering av röda blodkroppar i biologiska prover där andra celler såsom vita blodkroppar är av större intresse.
Recept:
- 150 mM ammoniumklorid
- 10 mM kaliumbikarbonat
- 0,1 mM EDTA
- Justera pH till 7,2-7,4
Lysbuffert i DNA- och RNA-studier
I studier som DNA-fingeravtryck används lysbufferten för DNA-isolering. Disktvål kan användas i ett nafs för att bryta ner cellen och kärnmembranen, vilket gör att DNA:t kan frigöras. Andra sådana lysbuffertar inkluderar den patenterade Qiagen-produkten Buffer P2.
- ^ Posch, Anton (2014-12-01). "Riktlinjer för provberedning för tvådimensionell elektrofores". Arkiv för fysiologi och biokemi . 120 (5): 192–197. doi : 10.3109/13813455.2014.955031 . ISSN 1744-4160 . PMID 25211021 . S2CID 42029377 .
- ^ Persika, Mandy; Marsh, Noelle; Miskiewicz, EwaI.; MacPhee, DanielJ. (2015-01-01). Kurien, Biji T.; Scofield, R. Hal (red.). Solubilisering av proteiner: betydelsen av val av lysisbuffert . Metoder i molekylärbiologi. Vol. 1312. Springer New York. s. 49–60. doi : 10.1007/978-1-4939-2694-7_8 . ISBN 9781493926930 . PMID 26043989 .
- ^ Posch, Anton (2008). 2D-SIDA: Provberedning och fraktionering . Humana Press. s. 24 . ISBN 978-1-58829-722-8 .
- ^ a b c d Angelägenheter, EMBL - Kontor av information och allmänhet. "Proteinrening - Extraktion och klarning - Val av lysbuffert och tillsatser - EMBL" . www.embl.de . Hämtad 2016-03-16 .
- ^ a b Linke, Dirk (2009-01-01). Deutscher, Richard R. Burgess och Murray P. (red.). Kapitel 34 Rengöringsmedel: En översikt . Metoder inom enzymologi . Guide till proteinrening, 2:a upplagan. Vol. 463. s. 603–617. doi : 10.1016/s0076-6879(09)63034-2 . ISBN 9780123745361 . PMID 19892194 .
- ^ "Tvättmedel för celllys och proteinextraktion" . www.thermofisher.com . Hämtad 2016-03-16 .
- ^ a b c Ji, Hong (2010-08-01). "Lys av odlade celler för immunutfällning" . Cold Spring Harbor Protocols . 2010 (8): pdb.prot5466. doi : 10.1101/pdb.prot5466 . ISSN 1940-3402 . PMID 20679375 .
- ^ a b c Sefton, Bartholomew M. (2001-01-01). "Märkning av odlade celler med 32Pian och förbereda celllysat för immunutfällning". Märkning av odlade celler med 32Pi och förberedelse av celllysat för immunutfällning . Aktuella protokoll inom molekylärbiologi . Vol. Kapitel 18. John Wiley & Sons, Inc. s. Enhet 18.2. doi : 10.1002/0471142727.mb1802s40 . ISBN 9780471142720 . PMID 18265167 . S2CID 20969356 .
- ^ ACK lyserande buffert
- ^ "ACK Lysis Buffert" . Cold Spring Harbor Protocols . 2014 (11): pdb.rec083295. 2014. doi : 10.1101/pdb.rec083295 .
- ^ "A10492 - ACK Lysing Buffer - US" .