L -Fotoleucin
|
|
|
|
| Namn | |
|---|---|
|
Föredraget IUPAC-namn
(2S ) -2-amino-3-(3-metyl-3H - diazirin-3-yl)propansyra |
|
| Andra namn l -2-amino-4,4-azi-pentansyra 3-(3-metyl-3-diazirinyl)-alanin |
|
| Identifierare | |
|
3D-modell ( JSmol )
|
|
| ChemSpider | |
|
PubChem CID
|
|
|
|
|
|
| Egenskaper | |
| C5H9N3O2 _ _ _ _ _ _ _ | |
| Molar massa | 143,146 g·mol -1 |
| 10 mg/ml | |
| Surhet (p K a ) | 2,36 (karboxyl)
|
|
Om inte annat anges ges data för material i standardtillstånd (vid 25 °C [77 °F], 100 kPa).
|
|
l -Fotoleucin är ett syntetiskt derivat av l - leucinaminosyran som används som dess naturliga analog och kännetecknas av att ha fotoreaktivitet, vilket gör den lämplig för att observera och karakterisera protein-proteininteraktioner (PPI). När ett protein som innehåller denna aminosyra (A) utsätts för ultraviolett ljus medan det interagerar med ett annat protein (B), förblir komplexet som bildas av dessa två proteiner (AB) fäst och kan isoleras för studier.
Foto-leucin, såväl som en annan fotoreaktiv aminosyra som härrör från metionin , fotometionin, syntetiserades första gången 2005 av Monika Suchanek, Anna Radzikoska och Christoph Thiele från Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics med syftet att identifiera protein till protein interaktion genom ett enkelt western blot-test som skulle ge hög specificitet.
De fotoreaktiva aminosyrornas likhet med de naturliga gör att de förstnämnda kan undvika de omfattande kontrollmekanismer som sker under proteinsyntesen i cellen.
Strukturera
Som nämnts i inledningen är l -fotoleucin ett syntetiskt derivat av l -leucinaminosyran. l -fotoleucin kännetecknas av närvaron av en diazirinring kopplad till R-radikalen i den ursprungliga aminosyran. Denna ringformade cyklopropenmolekyl består av en kolatom bunden till två kväveatomer genom en kovalent enkelbindning . Dessa två kväveatomer är samtidigt förbundna med varandra genom en dubbelkovalent bindning. Diazirinkolet är beläget i den position där den 2:a kolatomen i R-radikalen i l -leucin teoretiskt skulle vara, kopplad till det 1:a och 3:e kolet i denna teoretiska R-radikal. Diazirinringen ger fotoleucinen dess fotoreaktiva egenskap. När det bestrålas med UV-ljus spjälkas det och frigör kväve i gasform och lämnar en obunden kolatom (se Diazirin ). I protein-protein-interaktioner (PPI) är denna atom bunden till komplexet som bildas av de två proteiner som är känsliga för att studeras.
Resten av aminosyran har verkligen samma struktur som den ursprungliga l -leucinmolekylen, som inkluderar, som varje aminosyra, en aminogrupp och en karboxylgrupp bundna till ett α-kol, och en radikal som är bunden till detta kol atom. R-kedjan innehåller, i detta fall, en diazirinring och två extra kolatomer kopplade var och en till diazirinkolet som det tidigare nämnts.
För användning i biologiska experiment syntetiseras endast l - enantiomeren av fotoleucinaminosyran, så att den kan ersätta naturligt l -leucin. (Naturliga proteiner består endast av l -aminosyror; se homokiralitet .)
Syntes
l -Foto-leucin liknar l -leucin i sin struktur. Den senare innehåller emellertid en fotoaktiverbar diazirinring, vilket den förra inte gör, och som ger en reaktiv karben efter den ljusinducerade förlusten av kväve, vilket ger l -foto-leucin dess egenskaper. Denna fotoreaktiva aminosyra syntetiseras genom a-bromering av azi-karboxylsyran följt av aminolys av azi-brom-karboxylsyra.
Den klassiska proceduren för att syntetisera fotoleucin är baserad på följande steg:
- 4,4'-azi-pentansyra, CCl4 och tionylklorid upphettas till 65 °C i 30 minuter. Därefter tillsätts N-bromsuccinimid, CC14 och 48 % HBr och blandningen omrörs vid 55°C under 4 timmar. Lösningsmedlet och fritt brom avlägsnas under reducerat tryck och återstoden extraheras med 50 ml CC14 . Lösningsmedlet avlägsnas och den råa produkten (2-brom-4,4'-azi-pentanoylklorid) löses i aceton och hydrolyseras med vattenhaltig NaHCOa . Den råa bromerade fria syran erhålls efter surgöring med HCl och extraktion med diklormetan. Lösningsmedlet avlägsnas och produkten filtreras genom silikagel i isohexanacetat följt av avlägsnande av lösningsmedlet. Efter denna procedur kan vi lägga till en diazirinring till 4,4'-azi-pentansyran och slutligen erhålla dl-2- bromo -4,4'-azi-pentansyran.
- Aminolys av dl -2-brom-4,4'-azi-pentansyra utförs i ammoniakmättad metanol och 25 % vattenhaltig ammoniak under 5 dagar vid 55 °C. Efter avdunstning av ammoniaken tillsätts 20 ml koncentrerad HCl följt av indunstning av vattnet vid reducerat tryck. Den torra återstoden extraheras med 20 ml varm metanol och extraktet neutraliseras med N,N-dimetyletylamin. Efter att ha fått stå i 2 dagar vid -32°C bildades en fällning som isolerades och omkristalliserades två gånger från 70 % etanol för att ge ren dl -2-amino-4,4'-azi-pentonsyra.
- dl -2-amino-4,4'-azi-pentonsyra acetyleras för att erhålla acetylering dl -2-acetamino-4,4'-azi-pentansyra följt av enzymatisk deacetylering för att ge ren l -2-amino-4, 4'-azi-pentansyra, även känd som l -fotoleucin.
Nyligen har syntesen av fotoleucin förbättrats. Detta nya sätt att syntetisera fotoleucin kräver boc-(S)-foto-leucin, som framställs via ozonolys av en kommersiellt tillgänglig produkt, följt av bildning av diazirinet enligt Church och Weiss metod. Denna väg förutsätter en signifikant förbättring jämfört med den ursprungliga sexstegssyntesen av (S)-foto-leucin, som fortsatte med lågt utbyte och krävde enzymatisk upplösning av en racemisk mellanprodukt.
Aktivering
l -Fotoleucin får sin funktion efter att ha exponerats för UV- ljus. Detta gör att diazirinringen av l -foto-leucin förlorar sina kväveatomer i form av kvävgas och lämnar sin kolatom som en reaktiv fri radikal. Bindningarna som upprättas mellan detta kol, som tillhör ett protein (A), och atomer som tillhör ett annat protein (B) är ansvariga för de tvärbindande egenskaperna hos l -foto-leucin, som gör att det kan fästa dessa två peptidkedjor till en enkelkomplex (AB).
Den lämpliga våglängden för att aktivera l -foto-leucinmolekylen sträcker sig från 320 till 370 nanometer. Lampor med högre effekt är mer effektiva för att uppnå detta mål och gör det på kortare tid. Den ideala våglängden för aktiveringen av fotoleucinaminosyran är 345 nm.
För att öka effektiviteten måste en grund och otäckt plåt användas. Det kan också vara nödvändigt att rotera proverna placerade under UV-högern för att säkerställa att de får jämn UV-bestrålning, och därmed för att återigen förbättra tvärbindningseffektiviteten. Om tvärbindningen görs in vivo, inom levande celler, måste dessa exponeras för UV-strålningen under en period av 15 minuter eller mindre.
Används
I frånvaro av den ursprungliga aminosyran ( l -leucin ) i en miljö, används l -fotoleucin precis som sin naturligt förekommande analog i cellens proteinbearbetningsmekanismer. Därför kan det användas som ett substitut för leucin i proteinets primära struktur. Denna egenskap hos fotoleucin är mycket användbar för att studera protein-protein-interaktioner (PPI), på grund av det faktum att foto-leucinmolekylen, på grund av sin molekylära struktur, deltar i den kovalenta tvärbindningen av proteiner i protein-proteinet interaktionsdomäner (PPI) när den aktiveras av ultraviolett (UV) ljus. Detta faktum gör det möjligt att bestämma och beskriva stabila och övergående proteininteraktioner inom celler utan att använda några ytterligare kemiska tvärbindare, vilket kan skada cellstrukturen som studeras.
Studiet av dessa protein-protein-interaktioner är viktigt eftersom de är avgörande för att organisera cellulära processer i rum och tid. Faktum är att intresset för interaktioner mellan protein och protein är inte begränsat bara till grundforskning: många av dessa interaktioner involverade i viral fusion eller i tillväxtfaktorsignalering är lovande mål för antivirala läkemedel och läkemedel mot cancer. Fotoaffinitetsmärkning är ett kraftfullt verktyg för att identifiera proteinmål för biologiskt aktiva små molekyler och för att undersöka strukturen av ligandbindningsställen, varför fotoaminosyror, inklusive fotoleucin, är så användbara.
Proteinmärkning
Monika Suchanek, Anna Radzikowska och Christoph Thiele genomförde ett experiment där de framgångsrikt hade lyckats märka proteiner från cellerna i en apas njure (COS7).
Dessa celler odlades i ett medium med hög glukoshalt, från vilket ett prov på 3 cm^ togs bort för att fortsätta med western blotting. Vid cirka 70 % av konfluensen ersattes det initiala mediet med ett annat som saknade aminosyrorna metionin, leucin, isoleucin och valin, såväl som fenolrött.
Efteråt tillsattes foto-aminosyror till en slutlig koncentration av 4 mM foto-leucin och foto-isoleucin, 1,7 mM foto-metionin, och odlades i 22 timmar. När tiden väl var över tvättades cellerna med PBS och UV-bestrålades med en 200 W högtryckskvicksilverlampa med ett glasfilter som tog bort våglängder under 310 nm under 1 till 3 minuter. Detta påverkade inte cellens livsduglighet (som endast förändrades efter 10 minuters bestrålning). Cell drevs till lys och efterföljande western blotting för att analysera de isolerade tvärbundna komplexen.
MacKinnon AL et al. använde fotoleucin för att märka proteiner i en rå membranfraktion, vilket gjorde det möjligt för dem att identifiera den centrala delen av en translokationskanal inom membranet som är målet för cyklodepsipeptidinhibitorn.
Fördelar med fotoleucin som tvärbindare
Traditionellt har erkännandet av protein-proteininteraktioner utförts genom kemisk tvärbindning, som involverade användningen av måttligt reaktivt bifunktionellt reagens, vanligtvis fäst till fria aminogrupper. Emellertid är fotokemisk tvärbindning mycket mer specifik på grund av den korta livslängden för de exciterade mellanprodukterna. Dessutom interfererar inte fotokemisk tvärbindning med antikroppsigenkänningen medan den förra gör det.
Men fotoleucins fördelar sträcker sig längre, för förutom att det har många fördelar har det inga negativa effekter. Till exempel, även om onaturliga aminosyror i allmänhet är toxiska för celler, har fotoleucin visat sig inte ha någon väsentlig effekt på cellviabiliteten. Dessa resultat har bekräftats av många experiment. Till exempel visade en uppsats med Escherichia coli -galaktosidas att tillsatsen av någon av de tre fotoaminosyrorna eller av en blandning av dem inte hade någon effekt på enzymaktiviteten. Det hjälper till att dra slutsatsen att fotoaminosyror är icke-toxiska för odlade däggdjursceller och kan, åtminstone delvis, funktionellt ersätta deras naturliga former.
För närvarande används dock fotoreaktiva aminosyror i kombination med kemiska tvärbindare för att uppnå de mest tillförlitliga resultaten som möjligt inom protein-proteininteraktionsstudier.