Kassettmutagenes
Kassettmutagenes är en typ av platsriktad mutagenes som använder en kort, dubbelsträngad oligonukleotidsekvens ( genkassett) för att ersätta ett fragment av mål- DNA . Den använder komplementära restriktionsenzymspjälkningsändar på mål-DNA och genkassett för att uppnå specificitet. Det skiljer sig från metoder som använder en enda oligonukleotid genom att en enda genkassett kan innehålla flera mutationer. Till skillnad från många platsriktade mutagenesmetoder, involverar kassettmutagenes inte heller primerförlängning av DNA-polymeras .
Mekanism
Först används restriktionsenzymer för att klyva nära målsekvensen på DNA som finns i en lämplig vektor . Detta steg tar bort målsekvensen och allt mellan restriktionsställena. Sedan ligeras det syntetiska dubbelsträngade DNA:t innehållande den önskade mutationen och ändarna som är komplementära till restriktionsuppslutningsändarna i stället för den avlägsnade sekvensen. Slutligen sekvenseras den resulterande konstruktionen för att kontrollera att målsekvensen innehåller den avsedda mutationen .
Användande
Användningen av syntetisk genkassett tillåter total kontroll över vilken typ av mutation som kan genereras. När man studerar proteinfunktioner kan kassettmutagenes tillåta en forskare att ändra individuella aminosyror genom att introducera olika kodon eller utelämna kodon.
Genom att inkludera SD-sekvensen och de första kodonen av en gen, kan en forskare enkelt och dramatiskt påverka uttrycksnivån för ett protein genom att ändra dessa regulatoriska sekvenser .
Begränsningar
För att använda denna metod måste sekvensen för målsekvensen och närliggande restriktionsställen vara känd. Eftersom restriktionsenzymer används, för att denna metod ska vara användbar, måste restriktionsställena som flankerar mål-DNA:t vara unika i genen / vektorsystemet så att genkassetten kan infogas med specificitet. Längden på sekvensen som flankeras av restriktionsställena är också en begränsande faktor på grund av användningen av syntetiska genkassetter.
Fördelar
Eftersom en genkassett kan innehålla flera mutationer, behövs mindre total oligonukleotidsyntes och rening. Jämfört med mutagenesmetoder som kräver syntes av dubbelsträngat DNA med användning av en enkelsträngad mall (1-30 % in vitro i M13 ), är effektiviteten av ligeringen av oligodeoxinukleotidkassetten nära 100 %. Mutagenesens höga effektivitet innebär att mutanter kan screenas direkt genom sekvensering. När vektorn väl har satts upp med flankerande restriktionsställen kan alla manipulationer (dvs mutagenes , sekvensering , expression ) utföras i samma plasmid .