Mutagenes (molekylärbiologiteknik)
Inom molekylärbiologi är mutagenes en viktig laboratorieteknik där DNA- mutationer medvetet konstrueras för att producera bibliotek av muterade gener, proteiner, stammar av bakterier eller andra genetiskt modifierade organismer . De olika beståndsdelarna i en gen, såväl som dess regulatoriska element och dess genprodukter, kan muteras så att funktionen hos en genetisk plats, process eller produkt kan undersökas i detalj. Mutationen kan producera mutanta proteiner med intressanta egenskaper eller förbättrade eller nya funktioner som kan vara av kommersiell användning. Mutantstammar kan också produceras som har praktisk tillämpning eller som tillåter att den molekylära basen för en speciell cellfunktion kan undersökas.
Många metoder för mutagenes finns idag. Ursprungligen var den typ av mutationer som artificiellt inducerades i laboratoriet helt slumpmässiga med hjälp av mekanismer som UV-bestrålning. Slumpmässig mutagenes kan inte rikta in sig på specifika regioner eller sekvenser av genomet; emellertid, med utvecklingen av platsriktad mutagenes , kan mer specifika förändringar göras. Sedan 2013 har utvecklingen av CRISPR /Cas9-teknologin, baserad på ett prokaryotiskt viralt försvarssystem, möjliggjort redigering eller mutagenes av ett genom in vivo . Platsstyrd mutagenes har visat sig användbar i situationer som slumpmässig mutagenes inte är det. Andra tekniker för mutagenes inkluderar kombinatorisk och insertionell mutagenes. Mutagenes som inte är slumpmässig kan användas för att klona DNA, undersöka effekterna av mutagener och konstruera proteiner. Det har också medicinska tillämpningar som att hjälpa patienter med nedsatt immunförsvar, forskning och behandling av sjukdomar inklusive HIV och cancer, och bota sjukdomar som beta-talassemi .
Slumpmässig mutagenes
Tidiga metoder för mutagenes förlitade sig på metoder som producerade helt slumpmässiga mutationer. I sådana metoder exponeras celler eller organismer för mutagener såsom UV-strålning eller mutagena kemikalier, och mutanter med önskade egenskaper väljs sedan ut. Hermann Muller upptäckte 1927 att röntgenstrålar kan orsaka genetiska mutationer i fruktflugor , och fortsatte med att använda de mutanter han skapade för sina studier i genetik . För Escherichia coli kan mutanter selekteras först genom exponering för UV-strålning och sedan strykas ut på ett agarmedium. De bildade kolonierna replika-plateras sedan , en i ett rikt medium , en annan i ett minimalt medium, och mutanter som har specifika näringsbehov kan sedan identifieras genom deras oförmåga att växa i det minimala mediet. Liknande procedurer kan upprepas med andra typer av celler och med olika media för urval.
Ett antal metoder för att generera slumpmässiga mutationer i specifika proteiner utvecklades senare för att screena efter mutanter med intressanta eller förbättrade egenskaper. Dessa metoder kan involvera användning av dopade nukleotider i oligonukleotidsyntes , eller genomförande av en PCR- reaktion under förhållanden som förbättrar felinkorporering av nukleotider (felbenägen PCR), till exempel genom att reducera replikationens trohet eller använda nukleotidanaloger. En variant av denna metod för att integrera opartiska mutationer i en gen är sekvensmättnadsmutagenes . PCR-produkter som innehåller mutation(er) klonas sedan in i en expressionsvektor och de producerade mutantproteinerna kan sedan karakteriseras.
I djurstudier har alkyleringsmedel som N -etyl- N -nitrosourea (ENU) använts för att generera muterade möss. Etylmetansulfonat (EMS) används också ofta för att generera djur-, växt- och virusmutanter.
I en EU- lag (som 2001/18-direktivet) kan denna typ av mutagenes användas för att producera GMO , men produkterna är undantagna från reglering: ingen märkning, ingen utvärdering.
Platsstyrd mutagenes
Före utvecklingsteknikerna för platsstyrd mutagenes var alla mutationer som gjordes slumpmässiga, och forskare var tvungna att använda urval för den önskade fenotypen för att hitta den önskade mutationen. Slumpmässiga mutagenestekniker har en fördel när det gäller hur många mutationer som kan produceras; men även om slumpmässig mutagenes kan ge en förändring i enstaka nukleotider, ger den inte mycket kontroll över vilken nukleotid som ändras. Många forskare försöker därför introducera utvalda förändringar av DNA på ett exakt, platsspecifikt sätt. Tidiga försök att använda analoger av nukleotider och andra kemikalier användes först för att generera lokaliserade punktmutationer . Sådana kemikalier inkluderar aminopurin , som inducerar en AT till GC- övergång , medan nitrosoguanidin , bisulfit och N4 - hydroxicytidin kan inducera en GC till AT-övergång. Dessa tekniker tillåter specifika mutationer att konstrueras till ett protein; de är emellertid inte flexibla med avseende på de typer av mutanter som genereras, och de är inte heller lika specifika som senare metoder för platsstyrd mutagenes och har därför en viss grad av slumpmässighet. Andra teknologier som klyvning av DNA på specifika ställen på kromosomen, tillägg av nya nukleotider och utbyte av baspar är nu möjligt att bestämma var mutationer kan ta vägen.
Nuvarande tekniker för platsspecifik mutation härstammar från primerförlängningstekniken utvecklad 1978. Sådana tekniker involverar vanligtvis användning av prefabricerade mutagena oligonukleotider i en primerförlängningsreaktion med DNA-polymeras . Denna metod möjliggör punktmutation eller deletion eller infogning av små DNA-sträckor på specifika ställen. Framsteg inom metodiken har gjort sådan mutagenes nu till en relativt enkel och effektiv process.
Nyare och mer effektiva metoder för platsriktad mutagenes utvecklas ständigt. Till exempel tillåter en teknik som kallas "Seamless ligation cloning extract" (eller SLiCE för kort) kloning av vissa sekvenser av DNA i genomet, och mer än ett DNA-fragment kan infogas i genomet på en gång.
Platsstyrd mutagenes gör att effekten av specifik mutation kan undersökas. Det finns många användningsområden; till exempel har det använts för att fastställa hur mottagliga vissa arter var för kemikalier som ofta används i laboratorier. Experimentet använde platsriktad mutagenes för att efterlikna de förväntade mutationerna av den specifika kemikalien. Mutationen resulterade i en förändring i specifika aminosyror och effekterna av denna mutation analyserades.
Det platsriktade tillvägagångssättet kan göras systematiskt i sådana tekniker som alaninskanningsmutagenes , varvid rester systematiskt muteras till alanin för att identifiera rester som är viktiga för ett proteins struktur eller funktion. Ett annat omfattande tillvägagångssätt är mutagenes för sätesmättnad där ett kodon eller en uppsättning kodoner kan ersättas med alla möjliga aminosyror vid de specifika positionerna.
Kombinatorisk mutagenes
Kombinatorisk mutagenes är en platsstyrd proteinteknikteknik där flera mutanter av ett protein kan konstrueras samtidigt baserat på analys av effekterna av additiva individuella mutationer. Det ger en användbar metod för att bedöma den kombinatoriska effekten av ett stort antal mutationer på proteinfunktionen. Ett stort antal mutanter kan screenas för en speciell egenskap genom kombinatorisk analys. I denna teknik kan flera positioner eller korta sekvenser längs en DNA-sträng modifieras uttömmande för att erhålla ett omfattande bibliotek av mutanta proteiner. Frekvensen av fördelaktiga varianter kan förbättras genom olika metoder för att konstruera mutagenesbibliotek. Ett tillvägagångssätt för denna teknik är att extrahera och ersätta en del av DNA-sekvensen med ett bibliotek av sekvenser som innehåller alla möjliga kombinationer vid det önskade mutationsstället. Innehållet i det infogade segmentet kan inkludera sekvenser av strukturell betydelse, immunogena egenskaper eller enzymatisk funktion. Ett segment kan också infogas slumpmässigt i genen för att bedöma den strukturella eller funktionella betydelsen av en viss del av ett protein.
Insertionsmutagenes
Införandet av ett eller flera baspar, vilket resulterar i DNA-mutationer, är också känt som insättningsmutagenes . Konstruerade mutationer som dessa kan ge viktig information inom cancerforskningen, såsom mekanistiska insikter om utvecklingen av sjukdomen. Retrovirus och transposoner är de främsta instrumentella verktygen vid insättningsmutagenes. Retrovirus, som musmammörtumörvirus och murint leukemivirus, kan användas för att identifiera gener som är involverade i karcinogenes och förstå de biologiska vägarna för specifika cancerformer. Transposoner, kromosomala segment som kan genomgå transposition, kan designas och tillämpas på insertionsmutagenes som ett instrument för upptäckt av cancergen. Dessa kromosomala segment tillåter insättningsmutagenes att appliceras på praktiskt taget vilken vävnad som helst, samtidigt som de möjliggör ett mer omfattande, opartiskt djup i DNA-sekvensering.
Forskare har hittat fyra mekanismer för insättningsmutagenes som kan användas på människor. den första mekanismen kallas förstärkarinsättning. Enhancers ökar transkriptionen av en viss gen genom att interagera med en promotor av den genen. Denna speciella mekanism användes först för att hjälpa gravt immunförsvagade patienter som jag behöver av benmärg. Gammaretrovirus som bär förstärkare infogades sedan i patienter. Den andra mekanismen hänvisas till som promotorinsertion. Promotorer förser våra celler med de specifika sekvenser som behövs för att påbörja translation. Promotorinsättning har hjälpt forskare att lära sig mer om HIV-viruset. Den tredje mekanismen är geninaktivering. Ett exempel på geninaktivering är att använda insertionsmutagenes för att infoga ett retrovirus som stör genomet av T-cellen hos leukemipatienter och ger dem ett specifikt antigen som kallas CAR som gör att T-cellerna kan rikta in sig på cancerceller. De slutliga mekanismerna hänvisas till som mRNA 3'-ändsubstitution. Våra gener genomgår ibland punktmutationer som orsakar beta-talassemi som avbryter röda blodkroppars funktion. För att lösa detta problem införs den korrekta gensekvensen för de röda blodkropparna och en substitution görs.
Homolog rekombination
Homolog rekombination kan användas för att producera specifik mutation i en organism. Vektor som innehåller DNA-sekvens som liknar genen som ska modifieras introduceras till cellen och ersätter målgenen i kromosomen genom en rekombinationsprocess. Denna metod kan användas för att introducera en mutation eller slå ut en gen, till exempel som används vid produktion av knockoutmöss .
CRISPR
Sedan 2013 har utvecklingen av CRISPR -Cas9-teknologin möjliggjort ett effektivt införande av olika typer av mutationer i genomet hos en mängd olika organismer. Metoden kräver inte ett transposoninsättningsställe, lämnar ingen markör, och dess effektivitet och enkelhet har gjort den till den föredragna metoden för genomredigering .
Gensyntes
Eftersom kostnaden för DNA-oligonukleotidsyntes sjunker, är artificiell syntes av en komplett gen nu en gångbar metod för att introducera mutationer i en gen. Denna metod möjliggör omfattande mutationer på flera platser, inklusive den fullständiga omdesignen av kodonanvändningen av en gen för att optimera den för en viss organism.
Se även
externa länkar
|
Biblioteksresurser om Mutagenes |