Golden Gate-kloning
Golden Gate Cloning eller Golden Gate assembly är en molekylär kloningsmetod som gör det möjligt för en forskare att samtidigt och riktat sammanfoga flera DNA- fragment till ett enda stycke med hjälp av typ IIS-restriktionsenzymer och T4 DNA-ligas . Denna sammansättning utförs in vitro . De vanligaste enzymerna av typ IIS inkluderar Bsal, BsmBI och BbsI.
Till skillnad från standardtyp II-restriktionsenzymer som EcoRI och BamHI skär dessa enzymer DNA utanför sina igenkänningsställen och kan därför skapa icke-palindromiska överhäng . Eftersom 256 potentiella överhängssekvenser är möjliga kan flera fragment av DNA sättas samman genom att använda kombinationer av överhängssekvenser. I praktiken betyder detta att Golden Gate Cloning vanligtvis är ärrfri. Dessutom, eftersom slutprodukten inte har ett igenkänningsställe för typ IIS-restriktionsenzym, kan den korrekt ligerade produkten inte skäras igen av restriktionsenzymet, vilket betyder att reaktionen är väsentligen irreversibel.
Ett typiskt termocyklerprotokoll pendlar mellan 37 °C (optimalt för restriktionsenzymer) och 16 °C (optimalt för ligaser) många gånger. Även om denna teknik kan användas för en enda insättning, har forskare använt Golden Gate Cloning för att montera många bitar av DNA samtidigt.
Sömlös kloning
Ärrsekvenser är vanliga i DNA-sammansättning med flera segment. I multisegment-sammansättningsmetoden Gateway läggs segment till i donatorn med ytterligare att-sekvenser, som överlappar i dessa adderade segment, och detta resulterar i att segmenten separeras av att-sekvenserna. I BioBrick- sammansättning lämnas en ärrsekvens med åtta nukleotider, som kodar för ett tyrosin och ett stoppkodon, mellan varje segment som läggs till plasmiden.
Golden Gate-sammansättningen använder typ IIS-restriktionsenzymer som skär utanför deras igenkänningssekvenser. Samma typ IIS-restriktionsenzym kan också generera rikligt med olika överhäng på inläggen och vektorn, till exempel skapar Bsal 256 fyra baspars överhäng. Om överhängen är noggrant utformade, ligeras segmenten utan ärrsekvenser mellan dem, och den slutliga konstruktionen kan vara quasi-ärrfri, där restriktionsenzymställena finns kvar på båda sidor av insättningen. Eftersom ytterligare segment kan infogas i vektorerna utan ärr inom en öppen läsram , används Golden Gate flitigt inom proteinteknik .
Plasmiddesign
Även om Golden Gate Cloning påskyndar multisegmentkloning krävs noggrann design av givar- och mottagarplasmider. Forskare vid New England Biolabs har framgångsrikt demonstrerat sammansättningen av 35 fragment via en Golden Gate Assembly-reaktion med ett rör. Kritiskt för denna sammansättningsmetod är vektorryggraden för destinationsplasmiden och alla sammansättningsfragment flankerade av typ IIS-restriktionsenzymigenkänningsställen, eftersom denna subtyp av restriktionsenzymer skär nedströms från deras igenkänningsställen . Efter skärning har varje sammansättningsaktiva DNA-bit unika överhäng som härdar till nästa DNA-fragment i den planerade sammansättningen och blir ligerad, vilket bygger sammansättningen. Även om det också är möjligt för ett överhäng att härda tillbaka till sitt ursprungliga komplementära överhäng associerat med uppströmsigenkänningsstället och bli ligerat, vilket återbildar den ursprungliga sekvensen, kommer detta att vara känsligt för ytterligare skärning under hela sammansättningsreaktionen.
Kloningsstandarder
Restriktionsenzym-DNA-sammansättning har kloningsstandarder för att minimera förändringen i kloningseffektivitet och funktionen av plasmiden, vilket kan orsakas av kompatibilitet mellan restriktionsställena på insättningen och de på vektorn.
Golden Gate-sammansättningens kloningsstandarder har två nivåer. First-tier Golden Gate-sammansättningen konstruerar singelgenkonstruktionen genom att lägga till genetiska element som promotor, öppna läsramar och terminatorer. Sedan kombinerar andra skikts Golden Gate-montering flera konstruktioner gjorda i första skiktsmontering för att göra en multigenkonstruktion. För att uppnå andrastegsmontering används modulärt kloningssystem (MoClo) och GoldenBraid2.0-standarden.
MoClo System
Modulär kloning, eller MoClo, är en sammansättningsmetod som introducerades 2011 av Ernst Weber et al., där användaren med hjälp av restriktionsställen av typ IIS kan ligera samman minst sex DNA-delar till en ryggrad i en enpotsreaktion. Det är en metod baserad på Golden Gate Assembly, där typ IIS-restriktionsenzymer klyver sig utanför deras igenkänningsställe åt ena sidan, vilket gör det möjligt att ta bort dessa restriktionsställen från designen. Detta hjälper till att eliminera överskott av baspar, eller ärr, från att bildas mellan DNA-delar. Men för att ligera ihop ordentligt använder MoClo en uppsättning fusionsställen med 4 baspar, som finns kvar mellan delarna efter ligering, och bildar 4-baspar ärr mellan DNA-delarna i den slutliga DNA-sekvensen efter ligering av två eller flera delar.
MoClo använder en parallell metod, där alla konstruktioner från tier-one (nivå 0-moduler) har restriktionsställen för BpiI på båda sidor av skären. Vektorn (även känd som "destinationsvektor"), där gener kommer att läggas till, har ett utåtriktat Bsal-restriktionsställe med en bortfallsscreeningskassett. LacZ är en vanlig screeningkassett, där den ersätts av multigenkonstruktionen på destinationsvektorn. Varje skikt-ett-konstruktion och vektorn har olika överhäng på sig men ändå komplementära till överhänget av nästa segment, och detta bestämmer layouten för den slutliga multigenkonstruktionen. Golden Gate Cloning börjar vanligtvis med nivå 0-moduler. Men om nivå 0-modulen är för stor, kommer kloning att börja från nivå -1-fragment, som måste sekvenseras, för att hjälpa till att klona den stora konstruktionen. Om man börjar från nivå -1-fragment, behöver nivå 0-modulerna inte sekvenseras igen, medan om man börjar från nivå 0-moduler måste modulerna sekvenseras.
Nivå 0 moduler
Nivå 0-moduler är basen för MoClo-systemet, där de innehåller genetiska element som en promotor, en 5' otranslaterad region (UTR), en kodande sekvens och en terminator. För Golden Gate-kloning bör de interna sekvenserna av nivå 0-moduler inte innehålla typ IIS-restriktionsenzymställen för Bsal, BpiI och Esp3I medan de är omgivna av två Bsal-restriktionsställen i inverterad orientering. Nivå 0-moduler utan typ IIS-restriktionsplatser som flankerar kan lägga till BsaI-platserna under processen med Golden Gate-kloning.
Om nivå 0-modulerna innehåller något oönskat restriktionsställe, kan de muteras i silico genom att ta bort en nukleotid från typ IIS-restriktionsstället. I denna process måste man se till att den införda mutationen inte kommer att påverka den genetiska funktionen som kodas av sekvensen av intresse. En tyst mutation i den kodande sekvensen är att föredra, eftersom den varken förändrar proteinsekvensen eller funktionen hos genen av intresse.
Nivå -1 Fragment
Nivå -1-fragment används för att hjälpa till att klona stora nivå 0-moduler. För att klona nivå -1-fragment kan kloning med trubbiga ändar med restriktionsligering användas. Vektorn som används i kloningsnivå -1-fragment kan inte innehålla typ IIS-restriktionsställe BpiI som används för följande monteringssteg. Dessutom bör vektorn också ha en annan selektionsmarkör från destinationsvektorn i nästa monteringssteg, till exempel, om spektinomycinresistens används i nivå 0-moduler, bör nivå -1-fragment ha en annan antibiotikaresistens som ampicillin.
Nivå 1 konstruktioner
Destinationsvektorn på nivå 1 bestämmer positionen och orienteringen för varje gen i den slutliga konstruktionen. Det finns fjorton tillgängliga nivå 1-vektorer, som skiljer sig endast genom sekvensen av de flankerande fusionsställena samtidigt som de är identiska i de interna fusionsställena. Därför kan alla vektorer sätta ihop samma nivå 0-delar.
Eftersom alla nivå 1-vektorer är binära plasmider, används de för Agrobacterium- medierat temporärt uttryck i växter.
Nivå 2 konstruktioner
Nivå 2-vektorer har två inverterade BpiI-ställen från insättningen av nivå 1-moduler. Uppströmsfusionsstället är kompatibelt med en gen klonad i nivå 1-vektor medan nedströmsfusionsstället har en universell sekvens. Varje kloning tillåter att 2-6 gener infogas i samma vektor.
Att lägga till fler gener i ett kloningssteg rekommenderas inte, eftersom detta skulle resultera i felaktiga konstruktioner. Å ena sidan kan detta inducera fler restriktionsställen i konstruktionen, där denna öppna konstruktion tillåter ytterligare gener att läggas till. Å andra sidan kan detta också eliminera restriktionsställen, där denna nära konstruktion stoppar ytterligare tillägg av gener.
Därför behöver konstruktioner av mer än sex gener successiva kloningssteg, vilket kräver ändlänkare som innehåller interna Bsal- eller BsmBI-restriktionsställen och blå eller lila markörer. Varje kloningssteg måste alternera restriktionsstället och markören. Dessutom behövs två restriktionsenzymer, där BpiI används för att frigöra nivå 1-moduler från nivå 1-konstruktioner och Bsal/BsmBI är för att smälta och öppna mottagarnivå 2-n-plasmiden. Vid screening bör de korrekta kolonierna växla från blått till lila varje kloningssteg, men om en "sluten" ändlänkare används kommer kolonierna att vara vita.
Nivå M-konstruktioner
Nivå M-vektorer liknar nivå 2-vektorer, men har ett Bsal-ställe beläget uppströms om de två inverterade BpiI-ställena. När en eller flera gener klonas i en nivå M-vektor tillsätts en andra Bsal i slutet av konstruktionen via en nivå M-ändlänkare (ref). Detta gör att ett fragment som innehåller alla sammansatta gener kan skäras ut från vektorn och subklonas i en nästa nivå av kloning (nivå P).
Nivå P-konstruktioner
Nivå P-vektorer liknar nivå M-konstruktioner förutom att BpiI-ställena ersätts med Bsal-ställen och Bsal-ställena ersätts med BpiI-ställen. Flera nivå M-konstruktioner med kompatibla fusionsställen kan subklonas in i en nivå P-vektor i ett steg. Teoretiskt kan så många som 36 gener sättas samman i en konstruktion med användning av 6 parallella nivåer M-reaktioner (var och en krävs för sammansättning av 6 gener per nivå M-konstruktion) följt av en slutlig nivå P-reaktion. I praktiken sätts vanligtvis färre gener ihop då de flesta kloningsprojekt inte kräver så många gener. Strukturen av nivå M- och P-vektorer är utformad på ett sådant sätt att gener klonade i nivå P-konstruktioner kan sammansättas ytterligare i nivå M-vektorer. Upprepad kloning i nivå M- och P-vektorer bildar en loop som kan upprepas i det oändliga för att sätta ihop progressivt stora konstruktioner.
GoldenBraid
I standardkloning av Golden Gate kan restriktionsställena från den tidigare nivåkonstruktionen inte återanvändas. För att lägga till fler gener till konstruktionen måste restriktionsställen för ett annat restriktionsenzym av typ IIS läggas till destinationsvektorn. Detta kan göras med antingen nivå 2 eller M och P. En variantversion av nivå M och P tillhandahålls också av GoldenBraid.
GoldenBraid övervinner problemet med att designa många destinationsvektorer genom att ha en dubbel loop, som är "flätan", för att tillåta binär sammansättning av flera konstruktioner. Det finns två nivåer av destinationsplasmider, nivå a och nivå Ω. Varje nivå av plasmider kan användas som ingångsplasmider för den andra nivån av plasmider flera gånger eftersom båda nivåerna av plasmider har olika typ IIS-restriktionsställen som är i inverterad orientering. För motselektion skiljer sig de två nivåerna av plasmider i sina antibiotikaresistensmarkörer.
Golden Mutagenes
Golden Gate Cloning-principen kan också tillämpas för att utföra mutagenes som kallas Golden Mutagenes. Tekniken är enkel att implementera eftersom ett webbverktyg är tillgängligt för primerdesign ( https://msbi.ipb-halle.de/GoldenMutagenesisWeb/ ) och vektorerna deponeras på addgene ( http://www.addgene.org/browse /artikel/28196591/ ).
namn
Namnet Golden Gate Assembly kommer från ett förslag från Yuri Gleba. Den ska å ena sidan hänvisa till Gateway-tekniken , å andra sidan bilden den högre precisionen med en bro som sömlöst förbinder gatorna på två stränder. En av de mest kända broarna är Golden Gate Bridge i San Francisco .