In situ hybridisering
In situ hybridisering (ISH) är en typ av hybridisering som använder en märkt komplementär DNA , RNA eller modifierad nukleinsyrasträng (dvs. sond ) för att lokalisera en specifik DNA- eller RNA-sekvens i en del eller sektion av vävnad ( in situ ) eller om vävnaden är tillräckligt liten (t.ex. växtfrön, Drosophila -embryon), i hela vävnaden (hela ISH), i celler och i cirkulerande tumörceller (CTC). Detta skiljer sig från immunhistokemi , som vanligtvis lokaliserar proteiner i vävnadssnitt.
In situ hybridisering används för att avslöja platsen för specifika nukleinsyrasekvenser på kromosomer eller i vävnader, ett avgörande steg för att förstå geners organisation, reglering och funktion. De nyckeltekniker som för närvarande används inkluderar in situ till mRNA med oligonukleotid- och RNA-sonder (både radiomärkta och haptenmärkta), analys med ljus- och elektronmikroskop, helmonterad in situ- hybridisering, dubbeldetektion av RNA och RNA plus protein, och fluorescerande in situ hybridisering för att detektera kromosomala sekvenser. DNA ISH kan användas för att bestämma strukturen av kromosomer. Fluorescerande DNA ISH (FISH) kan till exempel användas inom medicinsk diagnostik för att bedöma kromosomal integritet. RNA ISH (RNA in situ hybridisering) används för att mäta och lokalisera RNA (mRNA, lncRNA och miRNA) inom vävnadssektioner, celler, hela monteringar och cirkulerande tumörceller (CTC). In situ hybridisering uppfanns av de amerikanska biologerna Mary-Lou Pardue och Joseph G. Gall .
Utmaningar med in-situ hybridisering
In situ-hybridisering är en kraftfull teknik för att identifiera specifika mRNA-arter inom enskilda celler i vävnadssnitt, vilket ger insikter i fysiologiska processer och sjukdomspatogenes. Emellertid kräver in situ hybridisering att många steg tas med exakt optimering för varje undersökt vävnad och för varje sond som används. För att bevara mål-mRNA:t i vävnader krävs det ofta att tvärbindande fixativ (såsom formaldehyd ) används.
Dessutom kräver in-situ hybridisering på vävnadssnitt att vävnadsskivorna är mycket tunna, vanligtvis 3 µm till 7 µm i tjocklek. Vanliga metoder för att förbereda vävnadssnitt för in-situ hybridiseringsbearbetning inkluderar skärning av prover med en kryostat eller en Compresstome vävnadsskärare . En kryostat tar färsk eller fixerad vävnad och sänker ner den i flytande kväve för snabbfrysning. Sedan bäddas vävnad in i frysmedier som kallas OCT och tunna sektioner skärs. Hinder inkluderar att få frysartefakter på vävnad som kan störa korrekt mRNA-färgning. Compresstome skär vävnad i tunna skivor utan en frysprocess ; fritt flytande sektioner skärs efter att ha bäddats in i agaros för stabilitet. Denna metod undviker frysning av vävnad och därmed associerade frysartefakter. Processen är permanent och oåterkallelig när den är klar.
Bearbeta
För hybridiseringshistokemi behandlas vanligtvis provceller och vävnader för att fixera måltranskripten på plats och för att öka åtkomsten av sonden. Som noterats ovan är proben antingen ett märkt komplementärt DNA eller, nu vanligast, ett komplementärt RNA ( riboprobe ). Sonden hybridiserar till målsekvensen vid förhöjd temperatur, och sedan tvättas överskottet av sonden bort (efter tidigare hydrolys med användning av RNas i fallet med ohybridiserat, överskott av RNA-sond). Lösningsparametrar såsom temperatur, salt och/eller tvättmedelskoncentration kan manipuleras för att ta bort eventuella icke-identiska interaktioner (dvs endast exakta sekvensmatchningar förblir bundna). Sedan lokaliseras och kvantifieras sonden som märkts med antingen radio-, fluorescens- eller antigenmärkta baser (t.ex. digoxigenin ) i vävnaden med antingen autoradiografi , fluorescensmikroskopi eller immunhistokemi . ISH kan också använda två eller flera prober, märkta med radioaktivitet eller de andra icke-radioaktiva markörerna, för att samtidigt detektera två eller flera transkript.
En alternativ teknologi, grenad DNA-analys , kan användas för RNA (mRNA, lncRNA och miRNA) in situ hybridiseringsanalyser med en molekylär känslighet utan användning av radioaktivitet. Denna metod (t.ex. ViewRNA-analyser) kan användas för att visualisera upp till fyra mål i en analys, och den använder patenterad sonddesign och bDNA-signalförstärkning för att generera känsliga och specifika signaler. Prover (celler, vävnader och CTC) fixeras och behandlas sedan för att möjliggöra RNA-måltillgänglighet (RNA-avmaskning). Målspecifika prober hybridiserar till varje mål-RNA. Efterföljande signalamplifiering bygger på specifik hybridisering av intilliggande prober (individuella oligonukleotider [oligos] som binder sida vid sida på RNA-mål). En typisk målspecifik prob kommer att innehålla 40 oligonukleotider, vilket resulterar i 20 oligopar som binder sida vid sida på målet för detektion av mRNA och lncRNA, och 2 oligon eller ett enda par för miRNA-detektion. Signalförstärkning uppnås via en serie av sekventiella hybridiseringssteg. En förförstärkarmolekyl hybridiserar till varje oligopar på det målspecifika RNA:t, sedan hybridiserar flera förstärkarmolekyler till varje förförstärkare. Därefter hybridiserar multipla märkningsproboligonukleotider (konjugerade till alkaliskt fosfatas eller direkt till fluoroforer) till varje förstärkarmolekyl. En helt sammansatt signalförstärkningsstruktur "Tree" har 400 bindningsställen för märkningsproberna. När alla målspecifika prober binder till mål-mRNA-transkriptet sker en 8 000-faldig signalamplifiering för det ena transkriptet. Separata men kompatibla signalförstärkningssystem möjliggör multiplexanalyserna. Signalen kan visualiseras med hjälp av ett fluorescens- eller ljusfältsmikroskop.
Grundläggande steg för digoxigeninmärkta prober
- permeabilisering av celler med proteinas K för att öppna cellmembran (cirka 25 minuter, behövs inte för vävnadssnitt eller vissa embryon i tidigt stadium)
- bindning av mRNA till markerad RNA-sond (vanligtvis över natten)
- antikropp-fosfatasbindning till RNA-sond (några timmar)
- färgning av antikropp (t.ex. med alkaliskt fosfatas )
Protokollet tar cirka 2–3 dagar och tar lite tid att installera. Vissa företag säljer robotar för att automatisera processen (t.ex. Intavis InsituPro VSi). Som ett resultat har storskaliga screeningar genomförts i laboratorier på tusentals gener. Resultaten kan vanligtvis nås via webbplatser (se externa länkar).
Se även
- Jin, L; Lloyd, RV (1997). "In situ hybridisering: metoder och tillämpningar" . Journal of Clinical Laboratory Analysis . 11 (1): 2–9. doi : 10.1002/(SICI)1098-2825(1997)11:1<2::AID-JCLA2>3.0.CO;2-F . PMC 6760707 . PMID 9021518 .
- Omfattande och kommenterad in situ hybridiseringshistokemi
- RNA-sekvensering av pankreatisk cirkulerande tumörceller implicerar WNT-signalering i metastaser
- Det lokala transkriptomet i den synaptiska neuropilen avslöjat genom djupsekvensering och högupplöst bildbehandling
externa länkar
- In+Situ+Hybridization vid US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
- Hybridisering in situ av RNA- och miRNA-sonder till celler, CTC:er och vävnader
- Helmonterad in situ-hybridisering av RNA-sonder till växtvävnader
- Beredning av komplexa DNA-sondset för 3D-FISKAR med upp till sex olika fluorokromer
- Transkription in situ-hybridisering av helmonterade embryon för fenotypanalys av RNAi-behandlad drosophila
- in-situ databaser: