Kromogen hybridisering in situ
Kromogen in situ hybridisering ( CISH ) är en cytogenetisk teknik som kombinerar den kromogena signaldetekteringsmetoden för immunhistokemi (IHC) tekniker med in situ hybridisering. Den utvecklades runt år 2000 som ett alternativ till fluorescens in situ hybridisering (FISH) för detektion av HER-2/neu onkogenamplifiering. CISH liknar FISH genom att de båda är in situ hybridiseringstekniker som används för att detektera närvaron eller frånvaron av specifika regioner av DNA. CISH är dock mycket mer praktiskt i diagnostiska laboratorier eftersom det använder ljusfältsmikroskop snarare än de dyrare och mer komplicerade fluorescensmikroskop som används i FISH.
Procedur
Sond design
Sonddesign för CISH är mycket lik den för FISH med skillnader endast i märkning och detektion. FISH-sonder är i allmänhet märkta med en mängd olika fluorescerande taggar och kan endast detekteras under ett fluorescensmikroskop, medan CISH-sonder är märkta med biotin eller digoxigenin och kan detekteras med ett ljusfältsmikroskop efter att andra behandlingssteg har applicerats.
CISH-sonder är cirka 20 nukleotider långa och är designade för DNA-mål. De är komplementära till målsekvensen och binder till den efter ett denaturerings- och hybridiseringssteg. Endast ett fåtal CISH-sonder är tillgängliga kommersiellt, så för de flesta applikationer måste de extraheras, amplifieras, sekvenseras, märkas och kartläggas från bakteriella artificiella kromosomer (BAC) . BAC utvecklades under Human Genome Project eftersom det var nödvändigt att isolera och amplifiera korta fragment av humant DNA för sekvenseringsändamål. Nuförtiden kan BAC väljas och placeras på det mänskliga genomet med hjälp av offentliga databaser som UCSC Genome Browser. Detta säkerställer optimal komplementaritet och sekvensspecificitet. DNA extraheras från BAC-klonerna och amplifieras med användning av en polymerasbaserad teknik, såsom degenererad oligonukleotidprimad (DOP)-PCR. Därefter sekvenseras klonerna och deras position på genomet verifieras. Sondmärkning kan utföras genom att använda antingen slumpmässig priming eller nick-translation för att införliva biotin eller digoxigenin .
Beredning av vävnad, hybridisering av prober och detektion
För att CISH ska fungera optimalt måste kromosomerna vara i antingen interfas eller metafas. Vävnadsprover fästs säkert på en yta, som vanligtvis är en glasskiva, med paraffin. Vävnadsproverna måste sedan tvättas och värmas flera gånger för att avlägsna eventuellt paraffin före hybridiseringssteget. Efter detta måste provet genomgå pepsindigestion för att säkerställa att målet är tillgängligt. Som ett sista steg tillsätts 10–20 μL sond, provet täcks med ett täckglas som förseglas med gummicement, och objektglaset värms upp till 97 °C i 5–10 minuter för att denaturera DNA:t. Objektglaset placeras sedan i en 37 ° C ugn över natten så att sonden kan hybridisera. Nästa dag tvättas provet och en blockerare för ospecifika proteinbindningsställen appliceras. Om pepparrotsperoxidas (HRP) ska användas måste provet inkuberas i väteperoxid för att undertrycka endogen peroxidasaktivitet. Om digoxigenin användes som en sondmärkning appliceras sedan en primär anti- digoxigeninfluoresceinantikropp följt av en HRP-konjugerad sekundär anti-fluoresceinantikropp. Om biotin användes som en sondmärkning måste ospecifika bindningsställen först blockeras med bovint serumalbumin (BSA) . Sedan används HRP-konjugerat streptavidin för detektion. HRP omvandlar sedan diaminobensidin (DAB) till en olöslig brun produkt, som kan detekteras i ett ljusfältsmikroskop under 40- till 60-faldig förstoring. En motfärgning som hematoxylin och eosin kan användas för att göra produkten mer synlig.
Jämförelse med andra tekniker
Jämfört med FISH
FISH anses vara guldstandarden för upptäckt av kromosomavvikelser eftersom den är mycket känslig och har hög upplösning. Andra tekniker som utvecklats för att upptäcka kromosomavvikelser jämförs vanligtvis med känsligheten och specificiteten hos FISH för att se hur de mäter sig. Till exempel, jämfört med FISH, har CISH visat sig ha en sensitivitet på 97,5 % och en specificitet på 94 % för detektion av HER-2/neu-genamplifiering. Överensstämmelsegraden mellan FISH och CISH var 94,8 %, vilket visar att CISH är en jämförbar teknik med FISH. De flesta andra källor är överens och rapporterar en nästan lika prestanda på genamplifieringsanalyser för FISH och CISH. Men ibland visar CISH lägre känslighet för lågnivåförstärkningar.
CISH har vissa fördelar jämfört med FISH i de reagenser och utrustning den använder. Som nämnts ovan är CISH mycket billigare och är lättare att använda eftersom det använder ljusfältsmikroskop istället för fluorescensmikroskop. Dessutom är CISH-reagensen mer stabila än FISH-reagensen så det är möjligt att lagra proverna och undersöka samma prov flera gånger. FISH-reagens bleknar med tiden på grund av fotoblekning så ett prov kan bara undersökas en gång. Förutom det dyra fluorescensmikroskopet kräver FISH också en högupplöst digitalkamera för att fånga mikrofotografier av provet innan fluorescensen bleknar. En annan fördel med att använda ljusfältsmikroskopi är att vävnads- eller cellprovet som helhet kan visualiseras genom CISH medan cellmorfologi är svår att bedöma med fluorescensmikroskopi i FISH.
CISH skiljer sig också från FISH i de sonder som används samt i den övergripande metoden. Det finns många olika typer av FISH-sonder tillgängliga, såsom upprepade prober, prober som detekterar specifika gener eller telomerer och prober som upptäcker kromosomavvikelser. Däremot finns det ett begränsat utbud av kommersiellt tillgängliga CISH-sonder, inklusive prober som binder centromeren av kromosomerna 3, 7, 8, 9, 10, 11, 17, 18, X och Y samt genspecifika prober för cancerrelaterade gener, såsom HER-2, EGFR, MYC och TOP2A. Trots det begränsade utbudet av tillgängliga CISH-sonder är de generellt sett mer kostnadseffektiva än FISH-sonder. När det gäller den övergripande metoden kan FISH utföras med hjälp av direkt märkning – fluorokromer fästs på proberna – eller indirekt märkning – proberna märks med biotin eller digoxigenin som sedan detekteras med hjälp av fluorescensmärkt streptavidin respektive antikroppar. CISH utförs med indirekt märkning där antikroppar eller streptavidin konjugeras till enzymer som HRP eller alkaliskt fosfatas (AP) .
Jämfört med IHC
CISH och IHC liknar varandra genom att båda används för samma ändamål (främst för att detektera HER-2/neu-amplifiering) och de använder båda enzymreaktioner (HRP/AP) för att mäta amplifiering. CISH och IHC är olika genom att IHC mäter proteinuttryck medan CISH mäter DNA-amplifiering. Denna skillnad är särskilt användbar för HER-2/neu eftersom det har visat sig att genamplifiering är av högre prognostiskt värde än proteinuttryck.
En nackdel med IHC är att det inte går att identifiera falsknegativa och falskt positiva resultat. I CISH, om det inte finns någon signal för referenssonden, har analysen misslyckats.
För lågt och högt proteinöveruttryck/genamplifiering visar CISH och IHC en överensstämmelse på över 86% respektive över 89%. Det har visat sig att monoklonala antikroppar är bättre än polyklonala antikroppar för detektion i både IHC och CISH då de binder mer specifikt, vilket leder till en högre konkordanshastighet.
För mediumproteinöveruttryck/genamplifiering varierar konkordansen, men är högre när monoklonala antikroppar används än när polyklonala antikroppar används. Den variabla överensstämmelsen beror på att genamplifiering inte strikt korrelerar med proteinuttryck och att tumörheterogenitet kan göra det svårt att upptäcka proteinöveruttryck i en vävnad.
Medicinska tillämpningar
CISH används ofta för att bedöma genamplifiering, såsom HER-2/neu-status i bröstcancerprover. HER-2/neu amplifiering är associerad med högre dödlighet, högre återfallsfrekvens och dålig prognos vid bröstcancer. Den monoklonala antikroppen trastuzumab är en receptorblockerare som har visat sig vara kliniskt mycket effektiv vid HER-2/neu-överuttryckande tumörer. Därför är det avgörande att fastställa receptorstatus innan cancerbehandling påbörjas.
CISH används också för detektion av kromosomala omarrangemang och fusioner, såsom fusion av ALK-tyrosinkinasdomän med promotorn och 5'-regionen av EML4 vid lungcancer. ALK-positiva tumörer är en kliniskt relevant undergrupp eftersom de kan behandlas mycket effektivt med ALK-hämmaren crizotinib.
Förutom cancer har CISH också visat sig vara användbart för att upptäcka humana papillomvirusinfektioner.
Variationer
Silverförstärkt in situ hybridisering (SISH)
SISH använder en liknande metod som CISH, men en silverfällning är slutprodukten snarare än en brun produkt. I denna metod binder en sond märkt med dinitrofenol (DNP) till målsekvensen. En primär anti-DNP-antikropp tillsätts sedan följt av en sekundär antikropp konjugerad till HRP. Silveracetat, hydrokinon och väteperoxid tillsätts därefter till den sekundära antikroppen och HRP katalyserar polymerisationen av silver i närvaro av väteperoxid. Silvermetall deponeras följaktligen i cellens kärnor. Amplifiering av HER-2/neu ses som svarta prickar.
DuoCISH
DuoCISH är en variant av CISH som tillgodoser behovet av två olika prober på samma objektglas. Det är en väletablerad teknik för HER-2/neu amplifieringsdetektion även om den ibland rapporteras vara mindre effektiv än FISH. I denna teknik binder en sond referensen som, i fallet med HER-2/neu amplifieringsdetektion, är CEN17 (centromeren av kromosom 17) medan den andra proben binder målsekvensen som är HER-2/neu. DuoCISH kombinerar både FISH och CISH genom att den omvandlar signaler från FISH-sonder till kromogena substrat. Det fungerar enligt principen att blå cyaninfärg är ett substrat för HRP och rött färgämne är ett substrat för AP. Till exempel omvandlas gröna fluoresceinisotiocyanat ( FITC) -signaler till blå kromogena fällningar genom en anti-FITC-antikropp konjugerad till HRP, och Texas Red-signaler omvandlas till röda kromogena fällningar genom en anti-Texas Red-antikropp konjugerad till AP. En fördel med DuoCISH är att det är möjligt att skilja på kromosomal aneuploidi och genamplifiering då referensgenen även kommer att amplifieras vid aneuploidi men inte vid genamplifieringsdetektion.