Identifiering av sjukdomsgen
Genidentifiering av sjukdomar är en process genom vilken forskare identifierar de muterade genotyper som är ansvariga för en ärftlig genetisk störning . Mutationer i dessa gener kan inkludera enstaka nukleotidsubstitutioner, enkelnukleotidtillägg/deletioner, deletion av hela genen och andra genetiska abnormiteter.
Betydelse
Kunskap om vilka gener (när de inte fungerar) som orsakar vilka störningar kommer att förenkla diagnosen av patienter och ge insikter om mutationens funktionella egenskaper. Tillkomsten av moderna med hög genomströmning kombinerat med insikter från det växande området genomik resulterar i snabbare identifiering av sjukdomsgen, vilket gör det möjligt för forskare att identifiera mer komplexa mutationer.
Generisk genidentifieringsprocedur
Sjukdomsgenidentifieringstekniker följer ofta samma övergripande procedur. DNA samlas först in från flera patienter som tros ha samma genetiska sjukdom. Därefter analyseras och screenas deras DNA-prover för att bestämma troliga regioner där mutationen potentiellt kan finnas. Dessa tekniker nämns nedan. Dessa troliga regioner är sedan uppradade med varandra och den överlappande regionen bör innehålla den muterade genen. Om tillräckligt med genomsekvens är känd, söks den regionen efter kandidatgener . Kodande regioner av dessa gener sekvenseras sedan tills en mutation upptäcks eller en annan patient upptäcks, i vilket fall analysen kan upprepas, vilket potentiellt begränsar området av intresse.
Skillnaderna mellan de flesta förfaranden för identifiering av sjukdomsgen är i det andra steget (där DNA-prover analyseras och screenas för att bestämma regioner där mutationen kan finnas).
Pre-genomics tekniker
Utan hjälp av hel-genomsekvenserna tittade pre-genomiska undersökningar på utvalda regioner av genomet, ofta med endast minimal kunskap om gensekvenserna de tittade på. Genetiska tekniker som kan tillhandahålla denna typ av information inkluderar RFLP-analys ( Restriction Fragment Length Polymorphism) och mikrosatellitanalys .
Förlust av heterozygositet (LOH)
Förlust av heterozygositet (LOH) är en teknik som endast kan användas för att jämföra två prover från samma individ. LOH-analys används ofta vid identifiering av cancerframkallande onkogener genom att det ena provet består av (mutant) tumör-DNA och det andra (kontroll)provet består av genomiskt DNA från icke-cancerceller från samma individ. RFLP och mikrosatellitmarkörer tillhandahåller mönster av DNA-polymorfismer, som kan tolkas som att de finns i en heterozygot region eller en homozygot region av genomet. Förutsatt att alla individer är drabbade av samma sjukdom som ett resultat av en manifestation av en deletion av en enda kopia av samma gen, kommer alla individer att innehålla en region där deras kontrollprov är heterozygot men mutantprovet är homozygot - denna region kommer att innehålla sjukdomsgen.
Postgenomiska tekniker
Med intåget av moderna laboratorietekniker som sekvensering med hög genomströmning och programvara som kan analysera hela genomet, har sekvensinsamling blivit allt billigare och mer tidskrävande, vilket ger betydande fördelar för vetenskapen i form av effektivare tekniker för identifiering av sjukdomsgen .
Identitet genom härkomstkartläggning
Identitet genom avstamning (IBD) kartläggning använder i allmänhet singelnukleotidpolymorfism (SNP) arrayer för att kartlägga kända polymorfa platser genom genomet hos drabbade individer och deras föräldrar och/eller syskon, både påverkade och opåverkade. Även om dessa SNP förmodligen inte orsakar sjukdomen, ger de värdefull insikt i sammansättningen av genomen i fråga. En region av genomet anses vara identisk genom härkomst om angränsande SNP delar samma genotyp. När man jämför en drabbad individ med hans/hennes drabbade syskon, registreras alla identiska regioner (t.ex. skuggade i rött i ovanstående figur). Med tanke på att ett drabbat syskon och ett opåverkat syskon inte har samma sjukdomsfenotyp måste deras DNA per definition vara olika (förutom närvaron av en genetisk eller miljömässig modifierare ). Således kan IBD-kartläggningsresultaten kompletteras ytterligare genom att ta bort alla regioner som är identiska hos både drabbade individer och opåverkade syskon. Detta upprepas sedan för flera familjer, vilket genererar ett litet, överlappande fragment, som teoretiskt innehåller sjukdomsgenen.
Homozygositet/autozygositetskartläggning
Homozygositet/Autozygositetskartläggning är en kraftfull teknik, men är endast giltig när man söker efter en mutation som segregerar inom en liten, sluten population. En så liten population, möjligen skapad av grundareffekten , kommer att ha en begränsad genpool, och därför kommer varje ärftlig sjukdom troligen att vara ett resultat av att två kopior av samma mutation segregerar på samma haplotyp . Eftersom drabbade individer troligen kommer att vara homozygota i regionerna, är att titta på SNP i en region en adekvat markör för regioner med homozygositet och heterozygositet. Moderna SNP-matriser används för att kartlägga genomet och identifiera stora regioner av homozygositet. Homozygota block i arvsmassan hos drabbade individer kan sedan läggas ovanpå varandra, och den överlappande regionen bör innehålla sjukdomsgenen.
Denna analys utökas ofta genom att analysera autozygositet , en förlängning av homozygositet, i genomen hos drabbade individer. Detta kan åstadkommas genom att plotta en kumulativ LOD-poäng vid sidan av de överlagrade blocken av homozygositet. Genom att ta hänsyn till populationsallelfrekvenserna för alla SNP via autozygositetskartläggning kan resultaten av homozygositet bekräftas. Dessutom, om två misstänkta regioner uppstår som ett resultat av homozygositetskartläggning, kan autozygositetskartläggning kunna skilja mellan de två (t.ex. om ett block av homozygositet är ett resultat av en mycket icke-diverserad region av genomet, kommer LOD-poängen att vara mycket låg).
Verktyg för kartläggning av homozygositet
- HomSI: en homozygot sträckidentifierare från nästa generations sekvenseringsdata Ett verktyg som identifierar homozygota regioner med hjälp av djupsekvensdata.
Genomomfattande knockdown-studier
Genomomfattande knockdown - studier är ett exempel på den omvända genetik som möjliggörs av förvärvet av hela genomsekvenser och tillkomsten av genomik och gen-tystnadsteknologier, främst siRNA och deletionskartläggning . Genomomfattande knockdownstudier involverar systematisk knockdown eller radering av gener eller segment av genomet. Detta görs vanligtvis i prokaryoter eller i en vävnadsodlingsmiljö på grund av det enorma antalet knockdowns som måste utföras. Efter att den systematiska knockouten är klar (och möjligen bekräftad av mRNA-expressionsanalys), kan de fenotypiska resultaten av knockdown/knockout observeras. Observationsparametrar kan väljas för att rikta in sig på en mycket specifik fenotyp. Den resulterande datamängden efterfrågas sedan för prover som uppvisar fenotyper som matchar sjukdomen i fråga – genen/generna som slås ner/ut i nämnda prov kan då betraktas som kandidatsjukdomsgener för individen i fråga.
Hel exome-sekvensering
Hel exome-sekvensering är en brute-force-strategi som innebär att man använder dagens moderna sekvenseringsteknik och DNA-sekvensmonteringsverktyg för att sätta ihop alla kodande delar av genomet. Sekvensen jämförs sedan med ett referensgenom och eventuella skillnader noteras. Efter att ha filtrerat bort alla kända benigna polymorfismer, synonyma förändringar och introniska förändringar (som inte påverkar splitsningsställen), kommer endast potentiellt patogena varianter att finnas kvar. Denna teknik kan kombineras med andra tekniker för att ytterligare utesluta potentiellt patogena varianter om fler än en identifieras.