Glykosyntas
Termen glykosyntas hänvisar till en klass av proteiner som har konstruerats för att katalysera bildandet av en glykosidbindning . Glykosyntas härrör från glykosidasenzymer , som katalyserar hydrolysen av glykosidbindningar . De bildades traditionellt från att bibehålla glykosidas genom att mutera den nukleofila aminosyran på det aktiva stället (vanligtvis ett aspartat eller glutamat ) till en liten icke-nukleofil aminosyra (vanligtvis alanin eller glycin ). Mer moderna metoder använder riktad evolution för att screena för aminosyrasubstitutioner som förbättrar glykosyntasaktivitet.
Det första glykosyntaset
Två upptäckter ledde till utvecklingen av glykosyntasenzymer. Den första var att en förändring av den aktiva nukleofilen i ett glykosidas från ett karboxylat till en annan aminosyra resulterade i ett korrekt veckat protein som inte hade någon hydrolasaktivitet . Den andra upptäckten var att vissa glykosidasenzymer kunde katalysera hydrolysen av glykosylfluorider som hade den felaktiga anomera konfigurationen. Enzymerna genomgick en transglykosideringsreaktion för att bilda en disackarid , som sedan var ett substrat för hydrolasaktivitet. 
Det första rapporterade glykosyntaset var en mutant av Agrobacterium sp. β-glukosidas/galaktosidas där nukleofilen glutamat 358 muterades till en alanin genom platsriktad mutagenes . När det inkuberades med a-glykosylfluorider och ett acceptorsocker befanns det katalysera transglykosideringsreaktionen utan någon hydrolys. Detta glykosyntas användes för att syntetisera en serie di- och trisackaridprodukter med utbyten mellan 64 % och 92 %.
Reaktionsmekanism
Mekanismen för ett glykosyntas liknar hydrolysreaktionen av kvarhållande av glykosidaser förutom att ingen kovalent-enzym-mellanprodukt bildas . Mutation av nukleofilen i det aktiva stället till en icke-nukleofil aminosyra förhindrar bildningen av en kovalent mellanprodukt. En aktiverad glykosyldonator med en bra anomer- avgående grupp (ofta en fluor) krävs. Den lämnande gruppen ersätts av en alkohol av acceptorsockret med hjälp av det aktiva ställets allmänna basaminosyra i enzymet.
Moderna tillbyggnader
Det första glykosyntaset var ett kvarhållande exoglykosidas som katalyserade bildningen av β1-4-kopplade glykosider av glukos och galaktos . Glykosyntasenzymer har sedan utökats till att inkludera mutanter av endoglykosidas , såväl som mutanter av inverterande glykosidas. Substrat av glykosyntas inkluderar glukos, galaktos, mannos , xylos och glukuronsyra . Moderna metoder för att framställa glykosyntas använder riktad evolution för att införa modifieringar, som förbättrar enzymernas funktion. Denna process gjordes tillgänglig på grund av utvecklingen av skärmar med hög genomströmning för glykosyntasaktivitet.
Begränsningar
Glykosyntas har varit användbart för framställning av oligosackarider ; deras användning lider dock av vissa begränsningar. För det första kan glykosyntas endast användas för att syntetisera glykosidbindningar för vilka det finns ett känt glykosidas. Det glykosidaset måste också först omvandlas till ett glykosyntas, vilket inte alltid är möjligt. För det andra är produkten av glykosyntasreaktionen ofta ett bättre substrat för glykosyntaset än utgångsmaterialet, vilket resulterar i bildningen av flera produkter av varierande längd. Slutligen är glykosyntas specifika för donatorsockret men har ofta lös specificitet för acceptorsockret. Detta kan resultera i olika regioselektivitet beroende på acceptorn vilket resulterar i produkter med olika glykosidbindningar. Ett exempel är Agrobacterium sp. β-glukosyntas, som bildar en β-1,4-glykosid med glukos som acceptor, men bildar en β-1,3-glykosid med xylos som acceptor.