Fenotyp mikroarray
Fenotyp -mikroarray -metoden är en teknik för fenotypning av celler med hög genomströmning . Ett fenotypmikroarraysystem gör det möjligt för en att samtidigt övervaka cellers fenotypiska reaktion på miljöutmaningar eller exogena föreningar på ett sätt med hög genomströmning. De fenotypiska reaktionerna registreras som antingen slutpunktsmätningar eller andningskinetik som liknar tillväxtkurvor .
Användningsområden
Fenotypiska tester med hög genomströmning blir allt viktigare för att utforska biologin hos bakterier , svampar , jästsvampar och djurcellinjer som mänskliga cancerceller . Precis som DNA-mikroarrayer och proteomteknologier har gjort det möjligt att analysera uttrycksnivån för tusentals gener eller proteiner på en gång, gör fenotypmikroarrayer (PM) det möjligt att kvantitativt mäta tusentals cellulära fenotyper samtidigt. Tillvägagångssättet erbjuder också potential för att testa genfunktion och förbättra genomannotering. I motsats till många av de hittills tillgängliga molekylära högkapacitetsteknologierna, bearbetas fenotypisk testning med levande celler, vilket ger omfattande information om hela cellers prestanda. De huvudsakliga tillämpningarna av PM-teknologin är inom områdena systembiologi , mikrobiell cellfysiologi , mikrobiologi och taxonomi , och däggdjurscellfysiologi inklusive klinisk forskning som om autism . Fördelar med PM jämfört med standardtillväxtkurvor är att cellandning kan mätas i miljöförhållanden där cellulär replikation (tillväxt) kanske inte är möjlig, och att den är mer exakt än optisk densitet , som kan variera mellan olika cellulära morfologier. Dessutom upptäcks vanligtvis andningsreaktioner mycket tidigare än celltillväxt.
Teknologi
En enda kolkälla som kan transporteras in i en cell och metaboliseras för att producera NADH genererar en redoxpotential och flöde av elektroner för att reducera ett tetrazoliumfärgämne , såsom tetrazoliumviolett , som ger en lila färg. Ju snabbare detta metaboliska flöde, desto snabbare bildas lila färg. Bildandet av lila färg är en positiv reaktion. tolkas så att den enda kolkällan används som energikälla. En mikroplattläsare och inkubationsanläggning behövs för att tillhandahålla lämpliga inkubationsförhållanden och för att automatiskt avläsa intensiteten av färgbildning under tetrazoliumreduktion i intervaller på t.ex. 15 minuter.
Huvudidén att hämta information om en organisms förmågor och dess speciella verkningssätt när man använder vissa energikällor kan tillämpas på motsvarande sätt på andra makronäringsämnen som kväve , svavel eller fosfor och deras föreningar och derivat. Som en förlängning kan effekten av auxotrofa kosttillskott eller antibiotika , tungmetaller eller andra hämmande föreningar på cellernas andningsbeteende bestämmas.
Datastruktur
Under en positiv reaktion förväntas den longitudinella kinetiken uppträda som sigmoidala kurvor i analogi med typiska bakterietillväxtkurvor . Jämfört med bakterietillväxtkurvor kan de andningskinetiska kurvorna ge värdefull information kodad i längden av eftersläpningsfasen λ, andningshastigheten μ (motsvarande sluttningens branthet), den maximala cellandningen A (motsvarande det maximala registrerade värdet ) och området under kurvan (AUC). I motsats till bakterietillväxtkurvor finns det vanligtvis ingen dödsfas i PM, eftersom det reducerade tetrazoliumfärgämnet är olösligt.
programvara
Proprietär och kommersiellt tillgänglig programvara finns tillgänglig som tillhandahåller en lösning för lagring, hämtning och analys av fenotypdata med hög genomströmning. En kraftfull gratis programvara med öppen källkod är "opm"-paketet baserat på R . "opm" innehåller verktyg för att analysera PM-data inklusive hantering, visualisering och statistisk analys av PM-data, som täcker kurvparameteruppskattning, dedikerade och anpassningsbara plotter, metadatahantering, statistisk jämförelse med genom- och vägannoteringar , automatisk generering av taxonomiska rapporter, datadiskretisering för fylogenetisk programvara och export i YAML markup language. Tillsammans med andra R-paket användes det för att tillämpa boosting för att analysera autism PM-data och detektera mer avgörande faktorer. "Opm"-paketet har utvecklats och underhålls hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen . En annan gratis programvara med öppen källkod som utvecklats för att analysera Phenotype Microarray-data är "DuctApe", ett Unix kommandoradsverktyg som också korrelerar genomisk data. Andra mjukvaruverktyg är PheMaDB, som tillhandahåller en lösning för lagring, hämtning och analys av fenotypdata med hög genomströmning, och programvaran PMViewer som fokuserar på grafisk visning men inte möjliggör ytterligare statistisk analys. Det senare är inte allmänt tillgängligt.