Elektronöverföringsdissociation
Elektronöverföringsdissociation ( ETD ) är en metod för att fragmentera flerladdade gasformiga makromolekyler i en masspektrometer mellan stegen av tandemmasspektrometri (MS/MS). I likhet med elektroninfångningsdissociation , inducerar ETD fragmentering av stora, flerfaldigt laddade katjoner genom att överföra elektroner till dem. ETD används flitigt med polymerer och biologiska molekyler som proteiner och peptider för sekvensanalys . Överföring av en elektron orsakar av peptidryggraden till c- och z-joner samtidigt som labila posttranslationsmodifieringar (PTM) lämnas intakta. Tekniken fungerar bara bra för högre laddningstillstånd peptid- eller polymerjoner (z>2). I förhållande till kollisionsinducerad dissociation (CID) är ETD emellertid fördelaktigt för fragmentering av längre peptider eller till och med hela proteiner. Detta gör tekniken viktig för top-down proteomics . Metoden har utvecklats av Hunt och medarbetare vid University of Virginia .
Historia
Elektroninfångningsdissociation (ECD) utvecklades 1998 för att fragmentera stora proteiner för masspektrometrisk analys. Eftersom ECD kräver en stor mängd nära-termiska elektroner (<0,2 eV), användes den ursprungligen uteslutande med Fourier-transformjoncyklotronresonansmasspektrometri (FTICR), den dyraste formen av MS-instrumentering. Mindre kostsamma alternativ som fyrpolig flygtid (Q-TOF), fyrpolig jonfälla (QIT) och linjär fyrpolig jonfälla (QLT) använde den mer energiintensiva kollisionsinducerade dissociationsmetoden (CID), vilket resulterade i slumpmässigt fragmentering av peptider och proteiner. 2004 Syka et al. tillkännagav skapandet av ETD, en dissociationsmetod som liknar ECD, men med en billig, allmänt tillgänglig kommersiell spektrometer. De första ETD-experimenten kördes på en QLT-masspektrometer med en elektrosprayjoniseringskälla (ESI).
Funktionsprincip
Flera steg är involverade i elektronöverföringsdissociation. Vanligtvis separeras en proteinblandning först med hjälp av högpresterande vätskekromatografi ( HPLC). Därefter genereras flera protonerade prekursormolekyler genom elektrosprayjonisering och injiceras i masspektrometern. (Endast molekyler med en laddning på 2+ eller högre kan användas i ETD.) För att en elektron ska kunna överföras till de positiva prekursormolekylerna genereras radikala anjoner och placeras i jonfällan med dem. Under jon/jonreaktionen överförs en elektron till det positivt laddade proteinet eller peptiden, vilket orsakar fragmentering längs peptidens ryggrad. Slutligen massanalyseras de resulterande fragmenten.
Radikal anjonberedning
I de ursprungliga ETD-experimenten användes antracen (C 14 H 10 ) för att generera reaktiva radikalanjoner genom negativ kemisk jonisering . Flera polycykliska aromatiska kolvätemolekyler har använts i efterföljande experiment, med fluoranten för närvarande det föredragna reagenset. Fluoranten har dock endast cirka 40 % effektivitet i elektronöverföring, så andra molekyler med låg elektronaffinitet letas efter.
Injektion och fragmentering
När prekursorkatjonerna (proteiner eller peptider) och radikalanjoner kombineras i jonfällan överförs en elektron till den mångfaldigt laddade katjonen. Detta bildar en instabil positiv radikalkatjon med en positiv laddning mindre och en udda elektron. Fragmentering sker längs peptidryggraden vid en N−Cα-bindning, vilket resulterar i fragmentjoner av c- och z-typ.
Massanalys
Fragmentering orsakad av ETD tillåter mer fullständig proteinsekvensinformation att erhållas från ETD-spektra än från CID-tandem-masspektrometri. Eftersom många joner av c- och z-typ av peptidryggrad detekteras, kan nästan fullständig sekvenstäckning av många peptider urskiljas från ETD-fragmenteringsspektra. Sekvenser av 15-40 aminosyror vid både N-terminalen och C-terminalen av proteinet kan avläsas med användning av massa-till-laddning- värden för de enkel- och dubbelladdade jonerna. Dessa sekvenser, tillsammans med den uppmätta massan av det intakta proteinet, kan jämföras med databasposter för kända proteiner och för att avslöja post-translationella modifieringar.
Instrumentation
Elektronöverföringsdissociation äger rum i en jonfälla- masspektrometer med en elektrosprayjoniseringskälla. De första ETD-experimenten vid University of Virginia använde en radiofrekvens quadrupole linjär jonfälla (LQT) modifierad med en kemisk joniseringskälla (CI) på baksidan av instrumentet (se diagram till höger). Eftersom ett spektrum kan erhållas på cirka 300 millisekunder, kopplas vätskekromatografi ofta med ETD MS/MS. Nackdelen med att använda LQT är att massupplösningsförmågan är mindre än för andra masspektrometrar.
Efterföljande studier har provat andra instrument för att förbättra massupplösningen. Med en negativ CI-källa på baksidan av instrumentet stör den högupplösta analysatorn i LQT-Orbitrap och quadrupole time-of-flight (QTOF), så alternativa joniseringsmetoder för de radikala anjonerna har införts.
2006 använde en grupp vid Purdue University under ledning av Scott McLuckey en quadrupol/time-of-flight (QqTOF) tandemmasspektrometer med pulsad nano-ESI/atmosfäriskt tryck kemisk jonisering (APCI) dubbel joniseringskälla med radikala anjoner på 1,3- dinitrobensen som elektrondonator. Senare anpassade ett labb vid University of Wisconsin en hybrid quadrupole linjär jonfälla-orbitrap masspektrometer för att använda ETD. Denna metod använde också en front-end joniseringsmetod för radikalanjonerna av 9-antracenkarboxylsyra via pulsade dubbla ESI-källor.
Eftersom ETD blir alltmer populärt för analys av protein- och peptidstrukturer, fortsätter implementeringen på lättillgängliga jonfälla-masspektrometrar i kombination med högupplösta massanalysatorer att utvecklas.
Ansökningar
Proteomics
ETD används i stor utsträckning vid analys av protein och stora peptider. Viktiga post translationella modifieringar inklusive fosforylering , glykosylering och disulfidbindningar analyseras alla med hjälp av ETD.
Polymerkemi
Även om MS-baserade analyser av polymerer till stor del har utförts med enstegs-MS, har tandem-MS också använts för att karakterisera polymerkomponenter. CID är den vanligaste dissociationsmetoden som används, men ETD har använts som en kompletterande metod. Unika bindningsklyvningar till följd av ETD tillhandahåller värdefull diagnostisk information.
Se även
| Jonkälla | |
|---|---|
| Massanalysator | |
| Detektor | |
| MS kombination | |
| Splittring | |
