Top-down proteomik
Top-down proteomics är en metod för proteinidentifiering som antingen använder en jonfångande masspektrometer för att lagra en isolerad proteinjon för massmätning och tandemmasspektrometri ( MS/MS) analys eller andra proteinreningsmetoder som tvådimensionell gelelektrofores i i samband med MS/MS. Top-down proteomics kan identifiera och kvantifiera unika proteoformer genom analys av intakta proteiner. Namnet kommer från det liknande tillvägagångssättet för DNA-sekvensering. Under masspektrometri joniseras typiskt intakta proteiner genom elektrosprayjonisering och fångas i en Fourier-transformjon-cyklotronresonans ( Penning trap ), fyrpolsjonfälla (Paul trap) eller Orbitrap -masspektrometer. Fragmentering för tandemmasspektrometri åstadkoms genom elektroninfångningsdissociation eller elektronöverföringsdissociation . Effektiv fraktionering är avgörande för provhantering före masspektrometri-baserad proteomik. Proteomanalys involverar rutinmässigt smältning av intakta proteiner följt av antagen proteinidentifiering med hjälp av masspektrometri (MS). Top-down MS (icke-gel) proteomik förhör proteinstruktur genom mätning av en intakt massa följt av direkt jondissociation i gasfasen.
Fördelar
- De främsta fördelarna med top-down-metoden inkluderar förmågan att detektera nedbrytningsprodukter, proteinisoformer , sekvensvarianter, kombinationer av posttranslationella modifieringar samt förenklade processer för datanormalisering och kvantifiering.
- Top-down proteomik, när den åtföljs av polyakrylamidgelelektrofores, kan hjälpa till att komplettera den proteomiska nedifrån och upp-strategin. Top-down proteomiska metoder kan hjälpa till att exponera stora avvikelser från förutsägelser och har eftersträvats mycket framgångsrikt genom att kombinera Gel Elution Liquid-based Fractionation Entrapment Elektroforesfraktionering, proteinfällning och omvänd fas HPLC med elektrosprayjonisering och MS/MS.
- Karakterisering av små proteiner representerar en betydande utmaning för bottom-up-proteomik på grund av oförmågan att generera tillräckligt med tryptiska peptider för analys. Top-down proteomik möjliggör lågmassaproteindetektion, vilket ökar repertoaren av kända proteiner. Medan Bottom-up proteomics integrerar kluvna produkter från alla proteoformer som produceras av en gen i en enda peptidkarta över genprodukten i full längd för att tabulera och kvantifiera uttryckta proteiner, är en stor styrka med Top-down proteomics att den gör det möjligt för forskare att kvantitativt spåra en eller flera proteoformer från flera prover och att skära ut dessa proteoformer för kemisk analys.
Nackdelar
- På senare tid förvisades uppifrån och ner-metoden till analys av enskilda proteiner eller enkla blandningar, medan komplexa blandningar och proteiner analyserades med mer etablerade metoder som Bottom-up proteomics. Dessutom kan proteinidentifiering och proteoformkarakterisering i TDP (Top-down proteomics) tillvägagångssätt drabbas av ett dynamiskt områdesutmaning där samma mycket rikliga arter fragmenteras upprepade gånger.
- Även om Top-down proteomik kan drivas med relativt hög effekt för att framgångsrikt kartlägga proteomtäckning på en stor nivå, minskar hastigheten för att identifiera nya proteiner efter inledande omgångar ganska kraftigt.
- Top-down proteomikförhör kan övervinna problem med att identifiera enskilda proteiner, men har inte uppnåtts i stor skala på grund av brist på intakta proteinfraktioneringsmetoder som är integrerade med tandemmasspektrometri.
Forskning och användningsområden
Studie ett: Kvantifiering och identifiering av tusentals mänskliga proteoformer under 30 kDa
- Forskare utförde en studie av mänskliga proteoformer under 30 kDa, använde primära IMR90 humana fibroblaster innehållande en Ras-funktionskonstruktion som odlades i medium.
- Valde att använda Top-Down Proteomics för att karakterisera dessa proteoformer eftersom det för närvarande är den bästa metoden för intakta proteiner, eftersom jag diskuterade Bottom Up smälter proteinet och inte gör ett bra jobb med att ge en tydlig bild av distinkta intakta proteoformer.
- Top Down Proteomics kan identifiera och kvantifiera unika proteoformer genom analys av intakta proteiner. Top-down kvantifieringen gav förändringar i överflöd av 1038 cytoplasmatiska proteoformer.
Studie två: Kombinera MALDI-TOF-masspektrometri med hög genomströmning och isoelektrisk fokuserande gelelektrofores för virtuell 2D-gelbaserad proteomik
- Forskare använde top-down proteomics eftersom de kunde identifiera de exakta proteoformerna av intakta proteiner, snarare än bottom-up-metoden som ger fragmentjoner av peptider.
- Denna studie använde Virtual 2D gel tillsammans med masspektrometri för att separera proteinblandningar. MALDI är en datorprogramvara som genererar de intakta massorna av proteinerna vid varje isoelektrisk punkt. Det började med en bild av ett IPG-IEF (isoelectric focusing) gelval som sedan analyserades av MALDI.
- Top-down proteomik MALDI-TOF/TOF-MS är mer tolerant mot föroreningar; kräver inte biomarkörextraktion, rening och separation; och kan appliceras direkt på intakta mikroorganismer.
Se även
Bibliografi
- Borchers CH, Thapar R, Petrotchenko EV, et al. (2006). "Kombinerad top-down och bottom-up proteomik identifierar ett fosforyleringsställe i stam-loop-bindande proteiner som bidrar till RNA-bindning med hög affinitet. " Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 103 (9): 3094–9. Bibcode : 2006PNAS..103.3094B . doi : 10.1073/pnas.0511289103 . PMC 1413926 . PMID 16492733 .
- Han X, Jin M, Breuker K, McLafferty FW (2006). "Utvidga top-down masspektrometri till proteiner med massor som är större än 200 kilodalton". Vetenskap . 314 (5796): 109–12. Bibcode : 2006Sci...314..109H . doi : 10.1126/science.1128868 . PMID 17023655 . S2CID 39929757 .
- Whitelegge J, Halgand F, Souda P, Zabrouskov V (2006). "Top-down masspektrometri av integrala membranproteiner". Expertgranskning av Proteomics . 3 (6): 585–96. doi : 10.1586/14789450.3.6.585 . PMID 17181473 . S2CID 21563381 .