Centrifugalt mikrofluidiskt biochip

LabDisk för analys av proteinstruktur via röntgenspridning med liten vinkel

Centrifugalmikrofluidbiochip eller centrifugalmikrofluidbioskiva är en typ av lab-on-a-chip- teknik, även känd som lab-on-a-disc, som kan användas för att integrera processer som separation, blandning, reaktion och upptäcka molekyler av nanostorlek i en enda del av plattformen, inklusive en CD eller DVD . Denna typ av mikrofluidiskt biochip är baserad på principen om mikrofluidik ; att dra fördel av icke-tröghetspumpning för lab-on-a-chip- enheter med icke-tröghetsventiler och omkopplare under centrifugalkraft och Coriolis-effekt för att fördela vätskor runt skivorna i en mycket parallell ordning.

Denna biodisk är en integration av flera tekniker inom olika områden. Designern måste vara bekant med processen för biologisk testning innan han designar de detaljerade mikrostrukturerna i CD-skivan. Vissa grundläggande elementkomponenter som ventiler, blandningsenheter och separeringsenheter bör alla användas för att slutföra hela testprocessen. De mest grundläggande principerna som tillämpas i sådana mikrofluidiska strukturer är centrifugalkraft , corioliseffekt och ytspänning . Mikrobearbetningsteknikerna , inklusive mönstring , fotolitografi och etsning bör alla användas så länge som designen är verifierad . När testprocessen är framgångsrik i biodisken startas den komplexa detekteringstekniken. Det finns många metoder som föreslagits av forskare inom detta område. Den mest populära metoden är immunanalys som används i stor utsträckning vid testning av biologi. Det sista steget är att ta emot data från biodisken med hjälp av en CD-enhet och modifiera antingen mjukvara eller hårdvara som kan uppnå denna funktion. En populär metod är att läsa data från biodisken med hjälp av en gemensam CD-enhet med någon utvecklad mjukvara, vilket har fördelen av att vara låg kostnad.

När det centrifugalmikrofluidiska biochipset väl har utvecklats tillräckligt bra för att kunna tillverkas i stor skala, kommer det att orsaka en bred effekt på såväl industrin som medicinsk vård, särskilt i utvecklingsländer, där högprecisionsutrustning inte är tillgänglig. ^{[ citat behövs ]} Människor i utvecklade länder som är villiga att göra sådana regelbundna upptäckter av hemtjänst kan också dra nytta av denna nya teknik.

Historia

Centrifugalmikrofluidplattformen, inklusive chipet och enheten, har varit i fokus för akademiska och industriella forskningsinsatser i nästan 40 år. I första hand inriktade på biomedicinska applikationer har en rad analyser anpassats på systemet. Plattformen har rönt framgång som ett forsknings- eller kliniskt verktyg och har kommersialiserats ytterligare nyligen. Icke desto mindre har denna mikrofluidiska lab-on-a-chip-teknik upplevt en hisnande ökning under de senaste 10–15 åren, och nya utvecklingar inom centrifugal mikrofluidikteknologier har potential att etablera omfattande användning av plattformen. Därför har olika vätskehanteringsplattformar utvecklats för att implementera enhetsoperationer såsom provtagning, provkonditionering, reagenstillförsel, mätning, alikvotering, ventilering, routing, blandning, inkubation, tvättning, såväl som analytiska eller preparativa separationer. Integreringen av sådan provberedning, inkubation, analys på en fristående skiva i en enhet som kontrollerar spinningen för automatisk prestanda uppmuntrar prov-till-svar-diagnos i den biomedicinska plattformen .

Dr Marc Madou vid UC Irvine är en av ledarna inom det centrifugala mikrofluidiska biochipset. Han har gjort flera forskningsprojekt på detta område och har gjort stora framgångar såsom pneumatisk pumpning i centrifugala mikrofluidplattformar, integration av 3D-kolelektroddielektrofores och seriell sifonventilering. Hans gruppmedlemmar arbetar med projekt inklusive cellys, PCR-kort, DNA-hybridisering, mjältbrandsdiagnostik och respiratorisk virusdetektion (se externa länkar). Dr. Hua-Zhong Yu på SFU.ca gjorde också stora framsteg på detta område och föreslog en ny digitaliserad molekylär diagnostikläsmetod och en ny DNA-detektionsmetod på plast-CD. (se externa länkar) Dr. Gang Logan Liu i UIUC fokuserar för närvarande också på detta område (se externa länkar).

Strukturdesign

Utformningen av strukturbaser på principen om mikrofluidik och typiska komponenter används i plattformen. många strukturer för centrifugala mikrofluidiska biochips har utvecklats, med fler intressanta som ännu inte har släppts. Madous grupp uppfann ventilkammarstrukturen 2004. Under de senaste åren släppte Saki Kondo den vertikala vätsketransportstrukturen, vilket gjorde att designen blev ett tredimensionellt koncept. Madous grupp uppfann också en seriell sifonventilkonstruktion som gör flödeskontrollen mycket enklare. Hong Chen skapade en spiralmikrokanal som tillåter parallell testning med fler steg.

Princip

Principen för det centrifugala mikrofluidiska biochipset inkluderar de grundläggande krafterna hos en partikel samt principen om flödeskontroll.

Pseudokrafter som verkar i centrifugalmikrofluidik. Medan centrifugalkraften alltid verkar radiellt utåt, verkar Corioliskraften vinkelrätt mot både ω och vätskehastigheten, och Eulerkraften är proportionell mot vinkelaccelerationen.

För en partikel i flödet är grundkrafterna centrifugalkraft , Corioliskraft , Eulerkraft och viskös kraft .

Centrifugalkraften spelar en roll som en pump i vätskan som strömmar. Det erbjuder den grundläggande källan för att överföra vätskan som strömmar från den inre radien av CD till den yttre radien. Storleken på centrifugalkraften bestäms av radien för partikelplacering och rotationshastigheten. Formeln för centrifugalkraftdensitet är:

$f_{\mathrm {\omega } }=N{\omega }^{2}r.$

där N är vätskans masstäthet, ω vinkelfrekvensen och r det radiella avståndet mellan partikeln och skivans centrum .

Formeln för Coriolis kraftdensitet är:

$f_{\mathrm {C} }=2N{\omega }u.$

där u är flödeshastigheten .

Corioliskraften genereras när vätskan har en hastighetskomponent längs den radiella riktningen. Denna kraft är i allmänhet mindre än centrifugalkraften när rotationshastigheten inte är tillräckligt hög. När det gäller en hög vinkelfrekvens gör Corioliskraften skillnad för vätskeflödet, som ofta används för att separera vätskeflödet i separationsenheten.

En annan grundläggande kraft är Eulerkraft , som ofta definieras som accelerationen av vinkelfrekvensen. Till exempel, när CD:n roterar med konstant hastighet, är Eulerkraften relativt långsam. Formeln för Euler kraftdensitet är:

$f_{\mathrm {E} }=Nr{\frac {d{\omega }}{dt}}.$

När det gäller en partikel i fluidflödet är den viskösa kraften:

$f_{\mathrm {v} }=v{\frac {\partial ^{2}u}{\partial x^{2}}}.$

v är vätskans viskositet.

När det gäller hela vätskeflödet spelar ytspänning en viktig roll vid flödeskontroll. När flödet kommer över ett varierat tvärsnitt kommer ytspänningen att balansera centrifugalkraften och som ett resultat blockera vätskeflödet. Högre rotationshastighet är nödvändig om vätskan vill komma in i nästa kammare. På så sätt delas flödesprocessen på grund av ytspänningen upp i flera steg vilket gör det enklare att realisera flödeskontroll.

Typisk komponent

Det finns olika typiska enheter i en centrifugal mikrofluidisk struktur, inklusive ventiler, volymmätning, blandning och flödesomkoppling. Dessa typer av enheter kan utgöra strukturer som kan användas på en mängd olika sätt.

Ventiler

Passiva ventiler som enbart aktiveras av centrifugalkrafter: (a) kapillär, (b) hydrofob, (c) sprängbar tätning, (d) centrifugopneumatiskt övertryck, (e) centrifugopneumatisk under tryck, (f) fjärrventilerad uppsamlingskammare (t.ex. genom att väta en upplösbar film56), (g) fjärrventilerad inloppskammare (t.ex. genom en clepsydra-struktur), (h) kapillärhävert, (i) överströmningshävert och (j) pneumatisk sifonventil.

Ventilernas princip är balansen mellan centrifugalkraft och ytspänning. När centrifugalkraften är mindre än ytspänningen kommer vätskeflödet att hållas i den ursprungliga kammaren; när centrifugalkraften överbalanserar ytspänningen på grund av en högre rotationshastighet kommer vätskeflödet att bryta ventilen och strömma in i nästa kammare. Detta kan användas för att styra flödesprocessen helt enkelt genom att styra skivans rotationshastighet.

De mest använda ventilerna inkluderar den hydrofila ventilen, den hydrofoba ventilen, sifonventilen och offerventilen.

När det gäller hydrofila och hydrofoba ventiler är genereringen av ytspänning nästan densamma. Det är den plötsliga förändringen av tvärsnittet av kanalen som genererar ytspänningen. Vätskeflödet kommer att hållas i en hydrofil kanal när tvärsnittet plötsligt blir stort, medan flödet kommer att hållas när tvärsnittet av hydrofob kanal plötsligt krymper.

Sifonventilen är helt enkelt baserad på sifonfenomenet. När kanalens tvärsnitt är tillräckligt litet kan vätskan i kammaren strömma längs kanalen på grund av ytspänning. Till skillnad från hydrofila eller hydrofoba ventiler fungerar ytspänningen som en pump i denna modell medan centrifugalkraften fungerar som motstånd istället.

Offerventilen är en ny teknik som styrs av laserbestrålning. Dessa offerventiler är sammansatta av nanopartiklar av järnoxid dispergerade i paraffinvax . Vid excitation med en laserdiod fungerar nanopartiklar av järnoxid i vaxet som integrerade nanovärmare, vilket gör att vaxet snabbt smälter vid relativt låga intensiteter av laserdiodexcitation. Ventilens funktion är oberoende av rotationshastigheten eller placeringen av ventilerna och möjliggör därför mer komplexa biologiska analyser integrerade på skivan.

Volymmätning

Alikvoteringsprincip.

Volymmätning är en typisk funktion av centrifugal fluidics för att nå en viss mängd flytande reagens. Det kan uppnås genom att helt enkelt ansluta en överströmningskanal till kammaren. När vätskan väl är i nivå med överströmningskanalen kommer resten av vätskan att ledas in i avfallskammaren som är ansluten till överströmningskanalen.

Blandning

Blandning är en viktig funktion inom mikrofluidik, som kombinerar olika reagenser för nedströmsanalys. Eftersom vätskan är innesluten i mikroskalan blir blandningen svår på grund av det låga Reynolds-talet med laminärt flöde. Det indikerar att det inte finns någon konvektiv blandning utan diffusion, vilket begränsar blandningsprocessen. Detta problem kan lösas med flera metoder. Ett typiskt sätt är att rotera skivan i olika riktningar, nämligen medurs och moturs rotation.

Flödesväxling

Flödesväxling är nödvändig när reagenser dirigeras till olika kammare. En vanlig metod för flödesomkoppling i en centrifugalanordning är att utnyttja Corioliskraften i en Y-formad struktur. När rotationshastigheten är för låg kommer vätskeflödet att följa den ursprungliga banan; när rotationshastigheten är tillräckligt hög, vilket är på nästan samma nivå som centrifugalkraften, kommer vätskeflödet att ledas in i en annan kammare.

Andra

Andra funktioner som sedimentering används också i mikrofluidiska plattformar vid behov. På grund av olika massa och radie mellan olika partiklar kan dessa partiklar separeras med viskositet och hastighet. På så sätt kan sedimentering av olika partiklar uppnås.

Material

Många strukturer kan formas med den vanligaste, snabba prototyptekniken, mjuk litografi med polydimetylsiloxan (PDMS). PDMS är en billig, klar elastomer polymer med gummiliknande mekaniska egenskaper vid rumstemperatur. I laboratoriet blandas PDMS i små omgångar, hälls i formar, till exempel poly(metylmetakrylat) (PMMA), med mikroskala egenskaper, och härdas vid måttliga temperaturer i minuter till timmar. Öppna PDMS-kanaler stängs genom att fästa kanallagerkomponenten på en glasskiva eller en andra, platt bit av PDMS. Inlopp och utlopp kan enkelt formas med hjälp av stansverktyg. Även om många ytmodifieringar inte är permanenta på PDMS på grund av dess relativt höga kedjerörlighet jämfört med polymerer, är PDMS fortfarande relevant som material för mikrofluidapplikationer.

termoplaster kommer till användning. Användningen av teknisk termoplast har många fördelar, även om de flesta av dessa fördelar ännu inte har realiserats. Det finns ett fåtal råvaruplaster som har visat sig vara lämpliga för medicinska mikrofluidapplikationer. Dessa inkluderar poly(metylmetakrylat) (PMMA), polystyren , polykarbonat och en mängd olika cykliska polyolefinmaterial . PMMA har goda optiska egenskaper för fluorescens, och UV-detektionslägen är relativt lätta att försegla till sig själva. Dessa finns i kvaliteter som är lämpliga för både formsprutning och formpressning. Polystyren är ett material känt för analysutveckling. Polykarbonater har en hög glasövergångstemperatur men dåliga optiska egenskaper för fluorescerande detektion. De cykliska polyolefinerna verkar ha den bästa kombinationen av optiska och mekaniska egenskaper.

Upptäckt

Signalsändning

Provberedning

Innan molekylerna reagerar med reagenserna bör de förberedas för reaktionerna. Det mest typiska är separation med centrifugalkraft. När det gäller blod, till exempel, kan sedimenteringen av blodkroppar från plasma åstadkommas genom att rotera biodisken under en tid. Efter separation kräver alla molekylära diagnostiska analyser ett steg av cell/viruslys för att frigöra genomiskt och proteomiskt material för nedströms bearbetning. Typiska lyseringsmetoder inkluderar kemiska och fysikaliska metoder. Den kemiska lyseringsmetoden, som är det enklaste sättet, använder kemiska rengöringsmedel eller enzymer för att bryta ner membran. Den fysiska lysen kan uppnås genom att använda pärlslagsystem på en skiva. Lys uppstår på grund av kollisioner och skjuvning mellan pärlorna och cellerna och genom friktionsskjuvning längs lyskammarens väggar.

ELISA/FIA

ELISA (enzymkopplade immunosorbentanalyser) och FIA (fluorescerande immunanalyser) är två metoder för immunanalyser . Immunanalyser är standardverktyg som används i klinisk diagnostik. Dessa tester förlitar sig på den specifika detekteringen av antingen antikroppen eller antigenet och utförs vanligtvis genom att märka antikroppen/antigenet av intresse på olika sätt, såsom fluorescerande eller enzymatiska märkningar. Men tvättning, blandning och inkubation tar alltid lång tid. När de integreras i mikrofluidbiodiskar blir detektionstiderna extremt korta och sådana typer av tester kan användas i stor utsträckning inom detta område.

I ELISA-metoden används enzymer för att producera en detekterbar signal från ett antikropp-antigenkomplex. I det första steget kommer eventuellt närvarande antigen att binda för att fånga antikroppar som har belagts på kanalens yta. Sedan detekterar antikroppar som lagts till för att binda till antigenet. Den enzymkopplade sekundära antikroppen följer de detekterande antikropparna och binder till dem. Slutligen, när substrat tillsätts, kommer det att omvandlas av enzym till en detekterbar form. Baserat på denna princip uppnådde Sergi Morais multiplexade mikroimmunoanalyser på en digital mångsidig skiva. Denna multiplexade analys kan uppnå detektionsgränser (IC10) på 0,06 μg/L och känsligheter på (IC50) 0,54 μg/L.

Förutom typiska ELISA-analyser, introduceras även fluorescerande immunanalyser (FIA) på en centrifugalmikrofluidisk anordning. Principen för FIA är nästan densamma med ELISA; den mest signifikanta skillnaden är att fluorescensmärkningar används istället för enzymer.

Nukleinsyraanalys

Nukleinsyraavkänning med hjälp av genspecifik nukleinsyraamplifiering med ett fluorescensfärgämne eller en sond, nukleinsyramikroarrayer, såsom DNA-mikroarrayer, har blivit viktiga verktyg för genetisk analys, genuttrycksprofilering och genetiskt baserad diagnostik. I den genspecifika nukleinsyraamplifieringen används standard PCR eller isoterm amplifiering, såsom loop-medierad isoterm amplifiering (LAMP), för att amplifiera den genetiska målmarkören med det DNA-bindande fluorescensfärgämnet eller en sekvensspecifik sond används för signalgenerering. Fluorescensen kan detekteras i en modifierad CD/DVD-enhet eller en skivenhet.

I nukleinsyramikroarrayerna kan processen för probimmobilisering och signalförstärkning separeras i fem steg. Ytan på mikrokanalen bestrålas först med UV-ljus i närvaro av ozon för att producera en hydrofil yta med en hög densitet av karboxylsyragrupper (steg 1). Sedan fästs sondmolekylerna (biotin, DNA eller humant plasma-IgG) kovalent till polykolytan via amidkoppling (steg 2). Senare märks målmolekylerna med fluorescerande taggar och detta biotinmärkta mål-DNA hybridiseras med sond-DNA:t immobiliserat på skivan (steg 3). Därefter binds guldnanopartiklar med målet via streptavidinkonjugat (steg 4). Silver deponeras sedan på guld-"fröet" (steg 5) för att öka partikelstorleken från några till flera hundra nanometer. Amplifieringen av fluorescens kommer att detekteras av detektionssystemet i CD-enheten.

Signalmottagning

Detektionssystemet bör kompletteras av den signalmottagande komponenten. Det finns ungefär tre typer av system som kan användas för att detektera. Den första är Modifiering av hårdvara och mjukvara , vilket innebär att CD/DVD-enheten bör modifieras och programvaran bör också utvecklas samtidigt. Denna typ kommer att orsaka överflödig arbetskraft och utgifter och kanske inte är mångsidig i utvecklingsländer eller ursprungsområden. Den andra typen är Programvarumodifiering med standardhårdvara , vilket innebär att detekteringen kan uppnås genom att utveckla kundprogramvara på plattformar som C++ utan att göra några ändringar i hårdvaran. Den tredje är Standard hårdvara och befintlig mjukvara , vilket innebär att detekteringen kan realiseras helt enkelt genom att använda befintlig utrustning. Manu Pallapa beskrev ett nytt protokoll för att läsa och kvantifiera biotin-streptavidin-bindningsanalyser med en standard optisk enhet genom att framgångsrikt använda en aktuell CD-dataanalysmjukvara (IsoBuster). De två sistnämnda typerna är båda betydande när man stöter på olika situationer.

Oavsett vilken typ av detektionssystem man använder är avläsningsmetoden en viktig faktor. Det finns främst två avläsningsmetoder, som är AAS (acquired analog signals) och ERD (error reading detection). I AAS-metoden, för att bestämma multianalyter på en DVD, korrelerar de analoga signalerna som förvärvas direkt från fotodioden på en CD/DVD-enhet väl med den optiska densiteten hos reaktionsprodukterna. ERD-metoden bygger på analys av läsfel. Den kan använda samma digitala mångsidiga disk och en standard DVD-enhet utan någon extra hårdvara.

ERD

I ERD-metoden motsvarar positionen och nivån för det resulterande avläsningsfelet den fysiska platsen respektive intensiteten hos bioanalyssignalen. Felen jämförs sedan med en perfekt inspelad CD för att identifiera tidpunkten när ett visst fel lästes ut. Det finns flera gratis diagnostiska program av CD-kvalitet, såsom PlexTools Professional, Kprobe och CD-DVD Speed, som kan användas för att komma åt felstatistikinformationen i en CD/DVD-enhet och för att skapa en plot som visar variationen av blockera felfrekvens som funktion av speltid. I en typisk 700 MB CD-R som innehåller 79,7 minuter ljuddata, till exempel, kan radien som felet inträffar beräknas från följande ekvation:

$r={\sqrt {{t \over 79,7}(58^{2}-25^{2})+25^{2}}}$

t är avläsningstiden och r är radieplatsen.

AAS

I AAS-metoden håller uppsättningen servosystem (fokus-, spårnings-, släde- och spindelservon) laserstrålen fokuserad på spiralspåren och tillåter skivrotation och laserhuvudrörelse under skanningen. Förstärknings-/detektionskortet (DAB) är integrerat i CD/DVD-enheten och innehåller en fotosensor och elektroniska kretsar för att förstärka RF-signalen som extraheras från fotodiodgivaren. Fotosensorn genererar en triggersignal när triggermärket detekteras. Båda signalerna förs till USB2.0-datainsamlingskortet (DAQ) för digitalisering och kvantifiering.

Se även

Anteckningar

Gorkin, Robert (2010). "Centrifugal mikrofluidik för biomedicinska tillämpningar". Lab on a Chip . 10 (14): 1758–73. arXiv : 1802.05610 . doi : 10.1039/b924109d . PMID 20512178 .
Ducree, Jens (2007). "Den centrifugala mikrofluidiska Bio-Disk-plattformen". J. Micromech. Microeng . 17 (7): 103–115. doi : 10.1088/0960-1317/17/7/s07 .
Siegrist, Jonathan (2010). "Seriell sifonventil för centrifugala mikrofluidplattformar" ( PDF) . Mikrovätska Nanovätska . 9 : 55–63. doi : 10.1007/s10404-009-0523-5 .
Li, Yunchao (2008). "Digitiserad molekylär diagnostik: Läsa diskbaserade bioanalyser med standarddatorenheter". Anal. Chem . 80 (21): 8216–8223. doi : 10.1021/ac8012434 . PMID 18821732 .
Li, Yunchao (2007). "DNA-detektion på plast: Ytaktiveringsprotokoll för att konvertera polykarbonatsubstrat till biochipplattformar". Anal. Chem . 79 (2): 426–433. doi : 10.1021/ac061134j . PMID 17222004 .
Brenner, Thilo (2005). "Frekvensberoende transversal flödeskontroll i centrifugal mikrofluidik". Lab on a Chip . 5 (2): 146–150. doi : 10.1039/b406699e . PMID 15672127 .
Lai, Siyi (2004). "Design av en Compact Disk-liknande mikrofluidisk plattform för enzymlänkad immunosorbentanalys". Anal. Chem . 76 (7): 1832–1837. doi : 10.1021/ac0348322 . PMID 15053640 .
Kondo, Saki (2010). "Vertikal vätsketransport genom kapillärbuntsstruktur med centrifugalkraft". Microsyst Technol . 16 (8–9): 1577–1580. doi : 10.1007/s00542-010-1111-z .
Chen, Hong (2010). "Ett roterande mikrofluidiskt arraychip för färgningsanalyser". Talanta . 81 (4–5): 1203–1208. doi : 10.1016/j.talanta.2010.02.011 . PMID 20441885 .
Klapperich, Catherine (2009). "Mikrofluidisk diagnostik: tid för industristandarder" . Expert Rev. Med. Enheter . 6 (3): 211–213. doi : 10.1586/erd.09.11 . PMID 19419277 .
Morais, Sergi (2009). "Multiplexade mikroimmunoanalyser på en digital mångsidig skiva". Anal. Chem . 81 (14): 5646–5654. doi : 10.1021/ac900359d . PMID 19522512 .
Pallapa, Manu (2010). "Programvarubaserad kvantifiering av bioanalyser på CD". Sensorer och ställdon . 148 (2): 620–623. doi : 10.1016/j.snb.2010.05.045 .
Morais, Sergi (2008). "Analytisk utsikt över kompaktskiva-teknik inom immunosensibilisering". Anal Bioanal Chem . 391 (8): 2837–2844. doi : 10.1007/s00216-008-2224-4 . PMID 18597081 .

externa länkar