Cellstörning
Cellstörning är en metod eller process för att frigöra biologiska molekyler inifrån en cell .
Metoder
Produktionen av biologiskt intressanta molekyler med hjälp av klonings- och odlingsmetoder möjliggör studier och tillverkning av relevanta molekyler. Förutom utsöndrade molekyler måste celler som producerar intressanta molekyler störas. Den här sidan diskuterar olika metoder. En annan metod för avbrott kallas celltakning .
Pärlmetoden
En vanlig mekanisk metod i laboratorieskala för cellavbrott använder glas-, keramik- eller stålpärlor, 0,1 till 2 mm i diameter, blandade med ett prov suspenderat i vattenhaltigt medium. Först utvecklad av Tim Hopkins i slutet av 1970-talet utsätts provet och pärlblandningen för hög nivå omrörning genom omrörning eller skakning. Pärlor kolliderar med cellprovet, spricker upp cellen för att frigöra intercellulära komponenter. Till skillnad från vissa andra metoder är mekanisk skjuvning måttlig under homogenisering, vilket resulterar i utmärkta membran- eller subcellulära preparat. Metoden, ofta kallad "beadbeating", fungerar bra för alla typer av cellmaterial – från sporer till djur- och växtvävnader. Det är den mest använda metoden för lysering av jäst och kan ge brytning på långt över 50 % (upp till 95 %). Den har fördelen jämfört med andra mekaniska cellavbrottsmetoder att den kan störa mycket små provstorlekar, bearbeta många prover samtidigt utan att det finns några risker för korskontaminering och frigör inte potentiellt skadliga aerosoler i processen.
I det enklaste exemplet på metoden tillsätts en lika stor volym pärlor till en cell- eller vävnadssuspension i ett provrör och provet blandas kraftigt på en vanlig laboratorievirvelblandare. Även om bearbetningstiderna är långsamma och tar 3-10 gånger längre än i specialskakmaskiner, fungerar den bra för celler som är lätta att rubba och är billig.
Framgångsrik pärlslagning beror inte bara på skakmaskinens designegenskaper (som tar hänsyn till skaksvängningar per minut, skakkast eller avstånd, skakorientering och ampullorientering), utan också valet av korrekt pärlstorlek (0,1–6 mm diameter) , pärlsammansättning (glas, keramik, stål) och pärlbelastning i flaskan.
I de flesta laboratorier utförs pärlslagning i satsstorlekar på en till tjugofyra förseglade plastflaskor eller centrifugrör. Provet och de små pärlorna omrörs med cirka 2000 svängningar per minut i specialdesignade fram- och återgående shakers som drivs av elmotorer med hög effekt. Cellavbrott är fullständigt efter 1–3 minuters skakning. Betydligt snabbare cellavbrottshastigheter uppnås med en pärlslagsvariant som kallas SoniBeast. Till skillnad från konventionella maskiner omrör den pärlorna med en virvelrörelse med 20 000 oscl/min. Större pärlslagarmaskiner som håller mikrotiterplattor med djupa brunnar förkortar också processtiderna, liksom pärldispensrar som är utformade för att snabbt ladda pärlor i flera flaskor eller mikroplattor. Förfyllda flaskor och mikroplattor finns också tillgängliga.
Alla pärlslagningsmaskiner med hög energi värmer provet ca 10 grader/minut. Detta beror på friktionskollisioner av pärlorna under homogenisering. Kylning av provet under eller efter pärlslagning kan vara nödvändigt för att förhindra skador på värmekänsliga proteiner såsom enzymer. Provvärmningen kan kontrolleras genom att pärlvispa under korta tidsintervall med kylning på is mellan varje intervall, genom att bearbeta flaskor i förkylda aluminiumflaskor eller genom att cirkulera gasformig kylvätska genom maskinen under pärlslagningen.
En annan beadbeater-konfiguration, lämplig för större provvolymer, använder en roterande fluorkolväterotor inuti en 15, 50 eller 200 ml kammare för att agitera pärlorna. I denna konfiguration kan kammaren omges av en statisk kylmantel. Med samma rotor/kammarkonfiguration finns stora kommersiella maskiner tillgängliga för att bearbeta många liter cellsuspension . För närvarande är dessa maskiner begränsade till att bearbeta monocellulära organismer som jäst, alger och bakterier.
Kryopulverisering
Prover med en seg extracellulär matris, såsom djurbindväv, vissa tumörbiopsiprover, venös vävnad, brosk, frön, etc. reduceras till ett fint pulver genom slagpulverisering vid temperaturer av flytande kväve. Denna teknik, känd som kryopulverisering, är baserad på det faktum att biologiska prover som innehåller en betydande del vatten blir spröda vid extremt kalla temperaturer. Denna teknik beskrevs först av Smucker och Pfister 1975, som hänvisade till tekniken som cryo-impacting. Författarna visade att celler effektivt bryts av med denna metod, vilket bekräftar genom fas- och elektronmikroskopi att brottplan korsar cellväggar och cytoplasmatiska membran.
Tekniken kan göras genom att använda en mortel och mortelstöt kylda till flytande kvävetemperaturer, men användningen av denna klassiska apparat är mödosam och provförlust är ofta ett problem. Specialiserade pulveriserare av rostfritt stål, allmänt kända som Tissue Pulverizers, finns också tillgängliga för detta ändamål. De kräver mindre manuell ansträngning, ger bra provåtervinning och är lätta att rengöra mellan proverna. Fördelarna med denna teknik är högre utbyten av proteiner och nukleinsyror från små, hårda vävnadsprover - särskilt när de används som ett preliminärt steg till mekaniska eller kemiska/lösningsmedelscellsbrytande metoder som nämnts ovan.
Högtryckscellstörning
Sedan 1940-talet har högtryck använts som en metod för cellavbrott, framför allt av French Pressure Cell Press, eller fransk press för kort. Denna metod utvecklades av Charles Stacy French och använder högt tryck för att tvinga celler genom en smal öppning, vilket får cellerna att lysera på grund av de skjuvkrafter som upplevs över tryckskillnaden. Även om franska pressar har blivit en basvara i många mikrobiologiska laboratorier, har deras produktion i stort sett lagts ner, vilket har lett till en återuppgång i alternativa tillämpningar av liknande teknologi.
Moderna fysiska cellstörare fungerar vanligtvis via antingen pneumatiskt eller hydrauliskt tryck. Även om pneumatiska maskiner vanligtvis är billigare, kan deras prestanda vara opålitliga på grund av variationer i bearbetningstrycket under hela luftpumpens slag. Det anses allmänt att hydrauliska maskiner erbjuder överlägsen lyseringsförmåga, särskilt vid bearbetning av svårare att bryta prover såsom jäst eller grampositiva bakterier , på grund av deras förmåga att upprätthålla konstant tryck under hela kolvslaget. Eftersom den franska pressen, som drivs av hydrauliskt tryck, kan lysa över 90 % av de vanligaste celltyperna tas den ofta som guldstandarden för lysprestanda och moderna maskiner jämförs ofta med den, inte bara när det gäller lysering effektivitet men också vad gäller säkerhet och användarvänlighet. Vissa tillverkare försöker också förbättra den traditionella designen genom att ändra egenskaper i dessa maskiner förutom trycket som driver provet genom öppningen. Ett sådant exempel är Constant Systems, som nyligen har visat att deras Cell Disruptors inte bara matchar prestanda hos en traditionell fransk press, utan också att de strävar efter att uppnå samma resultat med mycket lägre effekt.
Pressure Cycling Technology ("PCT"). PCT är en patenterad, möjliggörande teknologiplattform som använder alternerande cykler av hydrostatiskt tryck mellan omgivande och ultrahöga nivåer (upp till 90 000 psi) för att säkert, bekvämt och reproducerbart kontrollera molekylernas verkan i biologiska prover, t.ex. bristning (lys) av celler och vävnader från människor, djur, växter och mikrobiella källor, och inaktivering av patogener. PCT-förbättrade system (instrument och förbrukningsvaror) löser några utmanande problem som är inneboende i biologisk provberedning. PCT-fördelar inkluderar: (a) extraktion och återvinning av fler membranproteiner, (b) förbättrad proteinnedbrytning, (c) differentiell lysering i en blandad provbas, (d) patogeninaktivering, (e) ökad DNA-detektion och (f) utsökt provberedningsprocesskontroll.
Microfluidizer-metoden som används för cellavbrott påverkar starkt de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos den lyserade cellsuspensionen, såsom partikelstorlek, viskositet, proteinutbyte och enzymaktivitet. Under de senaste åren har Microfluidizer-metoden vunnit popularitet inom cellstörningar på grund av dess enkla användning och effektivitet för att störa många olika typer av celler. Microfluidizer-teknologin licensierades från ett företag som heter Arthur D. Little och utvecklades och användes först på 1980-talet, från början som ett verktyg för att skapa liposomer . Det har sedan dess använts i andra applikationer som cellavbrottsnanoemulsioner och reduktion av fast partikelstorlek, bland annat.
Genom att använda mikrokanaler med fast geometri, och en intensifierarpump, genereras höga skjuvhastigheter som spränger cellerna. Denna metod för cellys kan ge brytning av över 90 % av E. coli-celler.
Många proteiner är extremt temperaturkänsliga och kan i många fall börja denaturera vid temperaturer på endast 4 grader Celsius. Inom mikrokanalerna överstiger temperaturen 4 grader celsius, men maskinen är konstruerad för att svalna snabbt så att tiden som cellerna utsätts för förhöjda temperaturer är extremt kort ( uppehållstid 25 ms-40 ms). På grund av denna effektiva temperaturkontroll ger Microfluidizer högre nivåer av aktiva proteiner och enzymer än andra mekaniska metoder när proteinerna är temperaturkänsliga.
Viskositetsförändringar observeras också ofta när celler störs. Om cellsuspensionens viskositet är hög kan det göra nedströmshantering – såsom filtrering och exakt pipettering – ganska svårt. Viskositetsförändringarna som observeras med en Microfluidizer är relativt låga och minskar med ytterligare ytterligare passager genom maskinen.
I motsats till andra mekaniska störningsmetoder bryter Microfluidizer cellmembranen effektivt men försiktigt, vilket resulterar i relativt stora cellväggsfragment (450 nm), och därmed gör det lättare att separera cellinnehållet. Detta kan leda till kortare filtreringstider och bättre centrifugeringsseparation.
Microfluidizer-tekniken skalar från en milliliter till tusentals liter.
Kväve dekompression
För kvävedekompression löses först stora mängder kväve i cellen under högt tryck i ett lämpligt tryckkärl . Sedan, när gastrycket plötsligt släpps, kommer kvävet ut ur lösningen som expanderande bubblor som sträcker ut membranen i varje cell tills de spricker och släpper cellens innehåll.
Kvävedekompression är mer skyddande för enzymer och organeller än ultraljuds- och mekaniska homogeniseringsmetoder och jämförs positivt med den kontrollerade störande verkan som erhålls i en PTFE- och glasmortel- och mortelstöthomogenisator. Medan andra störande metoder är beroende av friktion eller en mekanisk skjuvverkan som genererar värme, åtföljs kvävedekompressionsproceduren av en adiabatisk expansion som kyler provet istället för att värma det.
Täcket av inert kvävgas som mättar cellsuspensionen och homogenatet ger skydd mot oxidation av cellkomponenter. Även om andra gaser: koldioxid , dikväveoxid , kolmonoxid och tryckluft har använts i denna teknik, är kväve att föredra på grund av dess icke-reaktiva natur och eftersom det inte ändrar pH i suspenderingsmediet. Dessutom är kväve att föredra eftersom det är allmänt tillgängligt till låg kostnad och vid tryck som är lämpliga för detta förfarande.
subcellulära substanser väl har släppts utsätts de inte för fortsatt nötning som kan denaturera provet eller orsaka oönskad skada. Det finns ingen anledning att se efter en topp mellan enzymaktivitet och procentuell störning. Eftersom kvävebubblor genereras i varje cell, appliceras samma störande kraft jämnt genom hela provet, vilket säkerställer ovanlig enhetlighet i produkten. Cellfria homogenat kan framställas.
Tekniken används för att homogenisera celler och vävnader, frigöra intakta organeller , förbereda cellmembran , frigöra labila biokemikalier och producera enhetliga och repeterbara homogenat utan att utsätta provet för extrem kemisk eller fysisk stress.
Metoden är särskilt väl lämpad för behandling av däggdjursceller och andra membranbundna celler. Det har också använts framgångsrikt för att behandla växtceller , för att frigöra virus från befruktade ägg och för att behandla ömtåliga bakterier . Det rekommenderas inte för obehandlade bakterieceller. Jäst , svamp , sporer och andra material med tuffa cellväggar svarar inte bra på denna metod.