Protospacer intilliggande motiv
En protospacer adjacent motiv ( PAM ) är en 2–6- baspar DNA- sekvens omedelbart efter DNA-sekvensen som målsöks av Cas9 - nukleaset i det bakteriella adaptiva immunsystemet CRISPR . PAM är en komponent i det invaderande viruset eller plasmiden, men finns inte i det bakteriella värdgenomet och är därför inte en komponent i det bakteriella CRISPR-lokuset . Cas9 kommer inte framgångsrikt att binda till eller klyva mål-DNA-sekvensen om den inte följs av PAM-sekvensen. PAM är en viktig målinriktad komponent som skiljer bakteriellt själv från icke-själv-DNA, vilket förhindrar att CRISPR-lokuset målinriktas och förstörs av det CRISPR-associerade nukleaset.
Spacers/protospacers
I ett bakteriegenom innehåller CRISPR-loci "spacers" (viralt DNA infogat i ett CRISPR-lokus) som i adaptiva immunsystem av typ II skapades från invaderande virus- eller plasmid-DNA (kallade "protospacers"). Vid efterföljande invasion, fäster ett CRISPR-associerat nukleas som Cas9 till ett tracrRNA - crRNA -komplex, vilket leder Cas9 till den invaderande protospacer-sekvensen. Men Cas9 kommer inte att klyva protospacer-sekvensen om det inte finns en intilliggande PAM-sekvens. Spacern i de bakteriella CRISPR-loci kommer inte att innehålla en PAM-sekvens och kommer således inte att skäras av nukleaset, men protospacern i det invaderande viruset eller plasmiden kommer att innehålla PAM-sekvensen och kommer således att klyvas av Cas9-nukleaset. I genomredigeringsapplikationer syntetiseras en kort oligonukleotid känd som ett guide-RNA (gRNA) för att utföra funktionen av tracrRNA-crRNA-komplexet för att känna igen gensekvenser som har en PAM-sekvens i 3'-änden , och därigenom "leda" nukleaset till en specifik sekvens som nukleaset är kapabelt att skära.
PAM-sekvenser
Den kanoniska PAM är sekvensen 5'-NGG-3', där "N" är vilken nukleobas som helst följt av två guanin ("G") nukleobaser. Guide-RNA kan transportera Cas9 till vilket lokus som helst i genomet för genredigering, men ingen redigering kan ske på någon annan plats än en där Cas9 känner igen PAM. Den kanoniska PAM är associerad med Cas9-nukleasen från Streptococcus pyogenes (betecknad SpCas9), medan olika PAM är associerade med Cas9-proteinerna från bakterierna Neisseria meningitidis , Treponema dentcola och Streptococcus thermophilus . 5'-NGA-3' kan vara en mycket effektiv icke-kanonisk PAM för mänskliga celler, men effektiviteten varierar med genomets placering. Försök har gjorts för att konstruera Cas9s för att känna igen olika PAMs för att förbättra förmågan hos CRISPR-Cas9 att redigera gener vid valfri genomplats.
Cas9 från Francisella novicida känner igen den kanoniska PAM-sekvensen 5'-NGG-3', men har konstruerats för att känna igen 5'-YG-3' (där "Y" är en pyrimidin ), vilket lägger till utbudet av möjliga Cas9-mål . Cpfl - nukleaset från Francisella novicida känner igen PAM 5'-TTTN-3' eller 5'-YTN-3'.
Bortsett från CRISPR-Cas9 och CRISPR-Cpf1, finns det utan tvekan många ännu oupptäckta nukleaser och PAM.
CRISPR/Cas13a (tidigare C2c2) från bakterien Leptotrichia shahii är ett RNA-styrt CRISPR-system som riktar sig mot sekvenser i RNA snarare än DNA. PAM är inte relevant för en RNA-inriktad CRISPR, även om en guanin som flankerar målet påverkar effekten negativt och har utsetts till ett "protospacer flanking site" (PFS).
GUIDE-Sekv
En teknologi som heter GUIDE-Seq har utvecklats för att analysera klyvningar utanför mål som produceras genom sådan genredigering. PAM-kravet kan utnyttjas för att specifikt rikta in sig på heterozygota mutationer med en nukleotid utan att utöva några avvikande effekter på vildtypsalleler.