Antikroppsmikroarray

Prover på skapelser och upptäckter av antikroppsmikroarrayer.

En antikroppsmikroarray (även känd som antikropparray ) är en specifik form av proteinmikroarray . I den här tekniken upptäcks en samling infångade antikroppar och fixeras på en fast yta som glas, plast, membran eller kiselchip, och interaktionen mellan antikroppen och dess målantigen detekteras. Antikroppsmikroarrayer används ofta för att detektera proteinuttryck från olika biovätskor inklusive serum, plasma och cell- eller vävnadslysat. Antikroppsuppsättningar kan användas för både grundforskning och medicinska och diagnostiska tillämpningar.

Bakgrund

Konceptet och metodiken för antikroppsmikroarrayer introducerades först av Tse Wen Chang 1983 i en vetenskaplig publikation och en serie patent, när han arbetade på Centocor i Malvern, Pennsylvania . Chang myntade termen "antikroppsmatris" och diskuterade "array"-arrangemang av små antikroppsfläckar på små glas- eller plastytor. Han visade att ett 10×10 (100 totalt) och 20×20 (400 totalt) rutnät av antikroppsfläckar kunde placeras på en 1×1 cm yta. Han uppskattade också att om en antikropp beläggs med en koncentration på 10 μg/ml, vilket är optimalt för de flesta antikroppar, kan 1 mg antikropp göra 2 000 000 punkter med en diameter på 0,25 mm. Changs uppfinning fokuserade på användningen av antikroppsmikroarrayer för detektion och kvantifiering av celler som bär vissa ytantigener, såsom CD-antigener och HLA- allotypiska antigener, partikelformiga antigener, såsom virus och bakterier, och lösliga antigener. Principen om "ett provapplicering, flera bestämningar", analyskonfiguration och mekanik för att placera absorberande prickar som beskrivs i papper och patent bör vara allmänt tillämplig på olika typer av mikromatriser . När Tse Wen Chang och Nancy T. Chang startade Tanox , Inc. i Houston, Texas 1986, köpte de rättigheterna på antikroppsmatrispatenten från Centocor som en del av den teknologiska basen för att bygga upp sin nya startup. Deras första produkt under utveckling var en analys, kallad "immunosorbent cytometri", som kunde användas för att övervaka immunstatusen, dvs koncentrationerna och förhållandena mellan CD3+, CD4 + och ^CD8 + T ^- celler , ⁱ blodet av HIV- infekterade individer.

Den teoretiska bakgrunden för proteinmikroarraybaserade ligandbindningsanalyser utvecklades vidare av Roger Ekins och kollegor i slutet av 1980-talet. Enligt modellen skulle antikroppsmikroarrayer inte bara möjliggöra samtidig screening av en analytpanel, utan skulle också vara känsligare och snabbare än konventionella screeningmetoder. Intresset för att screena stora proteinuppsättningar uppstod endast som ett resultat av framgångarna inom genomik genom DNA-mikroarrayer och Human Genome Project .

De första arraymetoderna försökte miniatyrisera biokemiska och immunbiologiska analyser som vanligtvis utförs i mikrotiterplattor med 96 brunnar. Medan 96-brunnars plattbaserade antikroppar har hög genomströmningskapacitet, begränsar den lilla ytan i varje brunn antalet antikroppsfläckar och därmed antalet detekterade analyter. Andra fasta underlag, såsom objektglas och nitrocellulosamembran, användes därefter för att utveckla arrayer som kunde rymma större paneler av antikroppar. Nitrocellulosamembranbaserade arrayer är flexibla, lätta att hantera och har ökad proteinbindningskapacitet, men är mindre mottagliga för hög genomströmning eller automatiserad bearbetning. Kemiskt derivatiserade glasskivor tillåter utskrift av antikroppsfläckar i sub-mikroliterstorlek, vilket minskar arrayytan utan att offra fläcktätheten. Detta minskar i sin tur mängden prov som konsumeras. Glasskivor baserade arrayer, på grund av sin släta och styva struktur, kan också enkelt monteras på vätskehanteringssystem med hög genomströmning.

De flesta antikroppssystem använder 1 av 2 icke-konkurrerande metoder för immunodetektion: detektion av singelantikroppar (etikettbaserad) och 2-antikroppsdetektion (sandwichbaserad). Den senare metoden, där analytdetektion kräver bindning av 2 distinkta antikroppar (en infångningsantikropp och en reporterantikropp, var och en binder till en unik epitop), ger större specificitet och lägre bakgrundssignal jämfört med märkningsbaserad immunodetektion (där endast 1 infångning antikropp används och detektion uppnås genom att kemiskt märka alla proteiner i startprovet). Sandwichbaserade antikroppar uppnår vanligtvis den högsta specificiteten och känsligheten (ng – pg-nivåer) av alla arrayformat; deras reproducerbarhet gör det också möjligt att utföra kvantitativ analys. På grund av svårigheten att utveckla matchade antikroppspar som är kompatibla med alla andra antikroppar i panelen, använder små arrayer ofta en sandwich-metod. Omvänt är högdensitetsarrayer lättare att utveckla till en lägre kostnad med användning av den enkla antikroppsmärkningsbaserade metoden. I denna metod används en uppsättning specifika antikroppar och alla proteiner i ett prov märks direkt av fluorescerande färgämnen eller haptener.

Initial användning av antikroppsbaserade array-system inkluderade att detektera IgG och specifika underklasser, analysera antigener, screena rekombinanta antikroppar , studera jästproteinkinaser, analysera autoimmuna antikroppar och undersöka protein-proteininteraktioner. Det första tillvägagångssättet för att samtidigt detektera flera cytokiner från fysiologiska prover med hjälp av antibody array-teknologi var av Ruo-Pan Huang och kollegor 2001. Deras tillvägagångssätt använde Hybond ECL-membran för att detektera en liten panel av 24 cytokiner från cellkulturkonditionerade media och patientens sera och var kunna profilera cytokinuttryck på fysiologiska nivåer. Huang tog denna teknik och startade ett nytt företag, RayBiotech, Inc., den första som framgångsrikt kommersialiserat en planar antikropparray.

Under de senaste tio åren har metodens känslighet förbättrats genom en optimering av ytkemin samt dedikerade protokoll för deras kemiska märkning. För närvarande är känsligheten hos antikroppsuppsättningar jämförbar med den för ELISA och antikroppsuppsättningar används regelbundet för profileringsexperiment på vävnadsprover, plasma- eller serumprover och många andra provtyper. Ett huvudfokus i antikroppsuppsättningsbaserade profileringsstudier är upptäckt av biomarkörer, specifikt för cancer. För cancerrelaterad forskning rapporterades utvecklingen och tillämpningen av en antikroppsuppsättning omfattande 810 olika cancerrelaterade antikroppar under 2010. Även 2010, en antikroppsuppsättning bestående av 507 cytokiner, kemokiner, adipokiner, tillväxtfaktorer, angiogena faktorer, proteaser, lösliga receptorer, lösliga adhesionsmolekyler och andra proteiner användes för att screena serum från äggstockscancerpatienter och friska individer och fann en signifikant skillnad i proteinuttryck mellan normala och cancerprover. På senare tid har antikroppar hjälpt till att bestämma specifika allergirelaterade serumproteiner vars nivåer är associerade med gliom och kan minska risken år före diagnos. Proteinprofilering med antikroppar har också visat sig vara framgångsrik inom andra områden än cancerforskning, särskilt inom neurologiska sjukdomar som Alzheimers. Ett antal studier har försökt identifiera biomarkörpaneler som kan särskilja Alzheimers patienter, och många har använt antikroppar i denna process. Jaeger och kollegor mätte nästan 600 cirkulationsproteiner för att upptäcka biologiska vägar och nätverk som påverkas av Alzheimers och utforskade de positiva och negativa sambanden mellan nivåerna av dessa individuella proteiner och nätverk med Alzheimers patienters kognitiva prestanda. För närvarande detekterar den största kommersiellt tillgängliga sandwich-baserade antikroppsuppsättningen 1000 olika proteiner. Dessutom finns antikroppsmikroarraybaserade proteinprofileringstjänster tillgängliga för att analysera proteinöverflöd och proteinfosforylering eller ubiquitinyleringsstatus för 1030 proteiner parallellt.

Antikroppsuppsättningar används ofta för att detektera proteinuttryck från många provtyper, men också i de med olika preparat. Jiang och kollegor illustrerade på ett bra sätt korrelationen mellan arrayproteinuttryck i två olika blodpreparat: serum och torkade blodfläckar. Dessa olika blodprovsberedningar analyserades med hjälp av tre antikroppsarray-plattformar: sandwich-baserade, kvantitativa och etikettbaserade, och en stark korrelation i proteinuttryck hittades, vilket tyder på att torkade blodfläckar, som är en mer bekväm, säker och billigare sätt att erhålla blod, särskilt i icke-sjukhusvårdsområden, kan användas effektivt med antikroppsuppsättningsanalys för upptäckt av biomarkörer, proteinprofilering och sjukdomsscreening, diagnos och behandling.

Ansökningar

Att använda antikroppsmikroarray i olika medicinska diagnostiska områden har väckt forskarnas uppmärksamhet. Digital bioassay är ett exempel på sådana forskningsdomäner. I den här tekniken är en rad mikrobrunnar på ett glas/polymerchip sådda med magnetiska pärlor (belagda med fluorescerande märkta antikroppar), utsätts för riktade antigener och karakteriseras sedan av ett mikroskop genom att räkna fluorescerande brunnar. En kostnadseffektiv tillverkningsplattform (med OSTE-polymerer ) för sådana mikrobrunnsuppsättningar har nyligen demonstrerats och bioanalysmodellsystemet har framgångsrikt karakteriserats. Vidare har immunanalyser på tiolen "syntetpapper" mikropelarställningar visat sig generera en överlägsen fluorescenssignal.

Se även