Rekombinanta antikroppar
Rekombinanta antikroppar är antikroppsfragment som produceras genom att använda gener som kodar för rekombinanta antikroppar . De består mestadels av en tung och lätt kedja av den variabla regionen av immunoglobulin . Rekombinanta antikroppar har många fördelar i både medicinska och forskningsapplikationer, vilket gör dem till ett populärt föremål för utforskning och nyproduktion mot specifika mål. Den vanligaste formen är det enkelkedjiga variabla fragmentet (scFv), som har visat de mest lovande egenskaperna som kan utnyttjas inom humanmedicin och forskning. I motsats till monoklonala antikroppar producerade med hybridomteknologi , som kan förlora kapaciteten att producera den önskade antikroppen över tid eller antikroppen kan genomgå oönskade förändringar, som påverkar dess funktionalitet, bibehåller rekombinanta antikroppar producerade i fagdisplay hög specificitetsstandard och låg immunogenicitet .
Struktur och karaktärisering
Format
Det finns flera kända format av rekombinanta antikroppar som vanligtvis produceras. Dessa är Fab- rekombinanta antikroppar, scFv och diakroppar. Vart och ett av formaten har en något olika potential i tillämpningar och kan användas inom olika forskningsområden såväl som human- och djurmedicin. En annan undersökt möjlighet är utvecklingen av anti-idiotypiska antikroppar. Anti-idiotypiska antikroppar binder till en paratop av en annan specifik antikropp. Därför kan den användas för att mäta närvaron av antikroppar och läkemedelsmängder i patienternas sera . Baserat på deras bindningsspecificitet kan 3 typer av anti-idiotypa antikroppar urskiljas, som delvis överlappar de tidigare nämnda formaten: de klassiska, en grupp som inkluderar Fab-fragmentantikroppar, antikroppar som binder till idiotop utanför läkemedelsbindningsstället och antikroppar , som binder endast till det redan sammansatta komplexet av läkemedel bundet till målet. De vanligast använda är scFv, Fab-fragment och bispecifika antikroppar.
Enkelkedjigt variabelt fragment (scFv)
scFv är det minsta av de rekombinanta antikroppsformaten, som kan binda till antigen . De har en molekylvikt på cirka 27 kDa. De bildas av lätt och tung kedja av den variabla regionen av ett immunglobulin. De två kedjorna är sammanlänkade av en flexibel peptidlinker . Den flexibla peptidlänken består vanligtvis av kort sekvensupprepning . Sekvensen består av fyra glyciner och ett serin och den tjänar syftet att stabilisera fragmentet. Funktionaliteten kan förbättras genom platsspecifika kemiska modifieringar, tillägg av en peptid-tagg eller genom fusion med en gen för att uppnå produktion av bifunktionella rekombinanta antikroppar. Det är viktigt att fastställa bindningsaktiviteten för att säkerställa god funktionalitet hos produkten. För att bestämma bindningsaktiviteten utförs rutinmässigt ELISA- analys.
Fab fragment
Strukturellt består Fab-fragment av två uppsättningar av variabla och konstanta komponenter, som skapar två polypeptidkedjor. Tillsammans bildar de en stabil struktur. Som en medlem av de anti-idiotypiska antikropparna binder Fab-fragment rekombinanta antikroppar direkt till paratopen av målantikroppen. Det betyder att de konkurrerar med läkemedlet om bindningsstället och har en hämmande funktion. Fab-fragmentantikroppar kan användas för detektion av icke bundna läkemedel eller fria läkemedel i serumet. Fab-antikroppar har också använts för att undvika de negativa effekterna orsakade av ospecifik bindning av Fc- delen av antikroppen, som saknas i Fab-fragmentet. Om IgG- immunoglobulinet var mer lämpligt för behandlingen eller någon annan speciell tillämpning, har experiment också utförts, i vilka de rekombinanta Fab-fragmenten omvandlades till rekombinant IgG-form. Denna möjlighet breddar poolen av potentiella målstrukturer ytterligare.
Bispecifika rekombinanta antikroppar
Tillsammans med scFv- och Fab-fragment är diakroppar eller bispecifika rekombinanta antikroppar det tredje huvudformatet. Bispecifika antikroppar kombinerar två olika antigenbindningsspecificiteter inom en molekyl. De bispecifika antikropparna används för att tvärbinda målmolekylerna med två olika celler och förmedla direkt cytotoxicitet .
Produktion och utveckling
Produktion av rekombinanta antikroppar
Produktionen av rekombinanta antikroppar följer huvudsakligen liknande arbetsflöde. Den består av att bestämma sekvensen för den önskade produkten följt av förfining av kodonet, sedan gensyntes och konstruktionsgenerering. När konstruktionen väl har levererats till laboratoriet produceras expressionskonstruktioner, sedan överförs de till en cellkultur i processen som kallas transfektion och när cellkulturen producerar den önskade rekombinanta antikroppen, samlas den regelbundet in, renas och analyseras eller används för ytterligare experimenterande. För rekombinant antikroppsproduktion används de stabila cellinjerna såsom CHO och HEK293. Optimering av cellkulturer från däggdjur har lett till att utbytet av antikroppar från HEK293- eller CHO-cellinjer ökat till över 12 g/liter. I början av den rekombinanta antikroppsproduktionen var det viktigt att åstadkomma sammansättningen av ett funktionellt Fv-fragment i Escherichia coli . Rätt veck är väsentligt för antikroppens funktionalitet. Den andra väsentliga förutsättningen för den moderna produktionen av scFv var den framgångsrika sammansättningen av rekombinanta antikroppar från tung och lätt kedja av immunglobulin. Dessa två experiment möjliggjorde ytterligare utveckling och förfining av de rekombinanta antikropparna fram till dagens moderna form. Dagens in vitro -produktionsprocess eliminerar behovet av försöksdjur. Att använda ett syntetiskt eller mänskligt Ab-bibliotek, i motsats till immunisering av djur och den efterföljande genereringen av stabila hybridomcellinjer, kräver färre resurser och producerar mindre avfall, vilket gör hela processen mer hållbar.
Hybridom
Monoklonala antikroppar är väsentliga för många behandlingar som används idag inom humanmedicin. Den första framgångsrika teknologin som var robust och ledde till en stabil produktion av önskade antikroppar var hybridomteknologin . Hybridomcellinjerna, som producerade stora mängder relativt rena och förutsägbara antikroppar, introducerades först 1975. Sedan dess har de använts för olika ändamål, från diagnostiska och terapeutiska till forskningsapplikationer. Trots sin obestridliga roll i vetenskapliga upptäckter och många behandlingsstrategier, presenterar hybridomteknologin forskare med vissa hinder såsom etiska frågor, potential att förlora uttrycket av målproteinet eller långvarig produktion och viktigast av allt utvecklingen av HAMA hos patienter som nämnts tidigare. Därför behöver olika metoder komplettera eller till och med delvis ersätta hybridomet. Hybridom är en väsentlig del av genereringen av rekombinanta antikroppar även idag eftersom de fortfarande används för att producera de monoklonala antikropparna, från vilka Fab-fragmenten, scFv eller somatiskt sammansmälta antikroppar skapar en bispecifik antikropp.
Phage display
Den mest använda tekniken för att producera rekombinanta antikroppar i laboratoriemiljöer idag är fagdisplayen . Fagdisplay är en metod där den rekombinanta målantikroppen produceras på ytan av en bakteriofag . Detta möjliggör en snabb rekombinant antikroppsproduktion och enkel manipulation under laboratorieförhållanden. Både scFv och Fab-fragment rekombinanta antikroppar produceras rutinmässigt med användning av antikroppsfagdisplayen. Från alla möjliga fagdisplaysystem är den vanligaste Escherichia coli , på grund av dess snabba tillväxt och delningshastighet och billiga uppställning och underhåll.
Teknik och utveckling
Två huvudstrategier har beskrivits för att konstruera scFv-fragmenten. Den första är den så kallade icke-kolineära metoden. Det fungerar på principen om heterodimerisering av två kedjor. Icke-kolineärt tillvägagångssätt leder till produktion av diakroppar och rekombinanta antikroppar, som kombinerar två specificiteter. Den andra metoden kallas colinear och den beskrev processen för fusion av två olika scFv med ett biologiskt aktivt protein.
Medicinska och forskningsapplikationer
Rekombinanta antikroppar fyller ett stort spektrum av funktioner som spänner från forskning till diagnos och behandlingsterapier för olika sjukdomar. Deras specificitet och låga immunogenicitet gör dem till ett utmärkt alternativ till traditionella behandlingsformer, vilket ökar noggrannheten för att rikta in sig på specifika molekyler och undviker negativa biverkningar.
Rekombinanta antikroppar har utforskats som en behandling för cancer , HIV , herpes simplex-virus (HSV) och mer. ScFv har varit en del av det mycket lovande terapeutiska tillvägagångssättet för universella chimära antigenreceptorer (uniCAR), som visar lovande resultat. scFv är en del av teknologin i form av målmoduler som styr immunsvaret mot specifika cancerceller som uttrycker målantigenet. Vid forskning om HIV-behandling används de rekombinanta antikropparna snarare för sin neutraliserande kvalitet . Detsamma gäller HSV-infektion. Specifika rekombinanta antikroppar är utformade för att binda till ytan av heparinsulfatproteoglykan (HSP), vilket komplicerar eller till och med inaktiverar inträdet av HSV i värdcellen. Detta är en metod som avsevärt minskar svårighetsgraden av HSV-infektion.
Som nämndes i början av detta avsnitt kan rekombinanta antikroppar också användas vid diagnos, ett exempel på sådan diagnostisk tillämpning är upptäckt av rabiesvirus . Eftersom de nuvarande diagnostiska antikropparna inte är så exakta som man skulle önska, erbjuder de rekombinanta antikropparna ett lovande alternativ. Vid rabiesinfektion, som bara kan behandlas kort efter exponering, är en noggrann och exakt diagnos avgörande för patientens överlevnad. I jämförelse med kommersiellt producerade och allmänt tillgängliga antikroppar är de rekombinanta antikropparna billigare att framställa och mer exakta när det gäller att fastställa infektionen. En annan fördel med den rekombinanta antikroppen är den potentiella användningen som en neutraliserande antikropp som en del av den efterföljande behandlingen.
Potentialen för rekombinanta antikroppar inom human- och djurmedicin är enorm, vilket även de få utvalda exemplen visar. Som tidigare nämnts är de rekombinanta antikropparna och speciellt de som har utvecklats vid fagdisplay mycket specifika, har utmärkt farmakokinetik och kan användas i ett stort antal behandlingar. Det är emellertid viktigt att inse att det inte förväntas eller önskas för de rekombinanta antikropparna som skapas i fagdisplay att fullständigt ersätta hybridomantikroppsproduktionen utan snarare komplettera den.
Fördelar med att använda rekombinanta antikroppar
Rekombinanta antikroppar ger många fördelar med sin tillämpning inom humanmedicin och forskning. Den första är att helt eliminera etiska frågor eftersom det inte finns något behov av djurimmunisering . Odlingen av CHO-celler för rekombinant antikroppsuttryck är en populär strategi för antikroppsproducenter eftersom cellstrukturen liknar den hos människokroppen. Tack vare deras storlek, som är mindre än komplett antikropp och i synnerhet än 2000 nm, men ändå inte mindre än 8 nm, rensas de från organismen med lätthet och i tid, genom njurvägen, vilket är det önskvärda clearance. En annan stor fördel är deras monovalens , vilket innebär att de är mycket specifika och binder till ett enda antigen. Forskare har lyckats producera antikroppar som inte har någon annan aktivitet än antigenbindningen. Eftersom de rekombinanta antikropparna är sekvensdefinierade är de mer tillförlitliga och reproducerbara. I kombination med deras ringa storlek kan den stora specificiteten utnyttjas för att leverera mycket specifikt läkemedel till ett specifikt ställe just eftersom den lilla storleken predisponerar de rekombinanta antikropparna att lättare penetrera vävnader. Det har rapporterats att de rekombinanta antikropparna penetrerar tumörvävnad bättre än IgG-immunoglobulinerna av full längd. Den lilla storleken bidrar också till bättre biodistribution hos patienten. I jämförelse med antikroppar härledda från hybridomcellinjer orsakar inte de rekombinanta antikropparna immunogenicitet, den ökända humana anti-mus-antikroppen (HAMA). Ytterligare fördelar visar afukosylerade rekombinanta antikroppar som används framgångsrikt i kampen mot cancer.
Dessa var de främsta fördelarna för användning hos patienter. Användningen av rekombinanta antikroppar är emellertid också fördelaktig jämfört med traditionella monoklonala antikroppar härledda från hybridomcellinjer även under deras produktion. Tillverkningen går mycket snabbare och vi har bättre kontroll över processen än inom hybridomteknologin. Dessutom kan de rekombinanta antikropparna utformas praktiskt taget mot vilket antigen som helst, av rätt storlek och form, men de är inte enbart begränsade till peptidnaturen hos ett antigen. De rekombinanta antikropparna kan också användas i fusionerad form med läkemedel och/eller toxiner, vilka kan utnyttjas ytterligare i medicinska tillämpningar. Sist men inte minst av deras fördelar under produktionen är möjligheten att optimera och genmanipulera de rekombinanta antikropparna baserat på den aktuella efterfrågan från patienten eller forskaren. En erfaren tekniker krävs för att utföra fagvisningen och för det tredje är det nästan oundvikligt att inkludera outsourca företag i processen för gensyntes och konstruktionsgenerering. I en systematisk jämförelse av antikroppar härledda från djur kontra fagdisplay-härledda rekombinanta antikroppar som används för forskning och diagnostiska tillämpningar släppte emellertid EU:s referenslaboratorium för alternativ till djurförsök (EURL ECVAM) en rekommendation till förmån för antikroppar som inte härrör från djur i maj 2020, huvudsakligen baserat på det faktum att rekombinanta antikroppar, i motsats till antikroppar från djur, alltid är sekvensdefinierade proteinreagenser, vilket gör det möjligt att eliminera några av de kvalitetsproblem som tillskrivs aktuella forskningsantikroppar när de tillverkas i djur.