Repressilator

Repressilatorn är ett genetiskt regulatoriskt nätverk som består av minst en återkopplingsslinga med minst tre gener , som var och en uttrycker ett protein som undertrycker nästa gen i slingan. Inom biologisk forskning har repressilatorer använts för att bygga cellulära modeller och förstå cellfunktion. Det finns både artificiella och naturligt förekommande repressilatorer. Nyligen har den naturligt förekommande repressilatorklockgenkretsen i Arabidopsis thaliana ( A. thaliana ) och däggdjurssystem studerats.

Konstgjorda repressilatorer

Konstgjorda repressilatorer konstruerades först av Michael Elowitz och Stanislas Leibler år 2000, som ett komplement till andra forskningsprojekt som studerar enkla system av cellkomponenter och funktion. För att förstå och modellera designen och de cellulära mekanismerna som ger en cells funktion skapade Elowitz och Leibler ett konstgjort nätverk bestående av en slinga med tre transkriptionsrepressorer . Detta nätverk designades från grunden för att uppvisa en stabil oscillation som fungerar som ett elektriskt oscillatorsystem med fasta tidsperioder. Nätverket implementerades i Escherichia coli ( E. coli) via rekombinant DNA-överföring. Det verifierades sedan att de konstruerade kolonierna verkligen uppvisade det önskade oscillerande beteendet.

Repressilatorn består av tre gener sammankopplade i en återkopplingsslinga , så att varje gen undertrycker nästa gen i slingan och undertrycks av den föregående genen. I den syntetiska insättningen i E. Coli användes grönt fluorescerande protein (GFP) som reporter så att nätverkets beteende kunde observeras med fluorescensmikroskopi .

Repressilatorns genetiska regulatoriska nätverk, där varje protein som översätts av en gen undertrycker nästa i cykeln.

Utformningen av repressilatorn styrdes av biologiska principer och kretsprinciper med diskreta och stokastiska analysmodeller. Sex differentialekvationer användes för att modellera kinetiken för repressilatorsystemet baserat på protein- och mRNA -koncentrationer, såväl som lämpliga parameter- och Hill-koefficientvärden . I studien genererade Elowitz och Leibler siffror som visar svängningar av repressorproteiner, med hjälp av integration och typiska parametervärden samt en stokastisk version av repressilatormodellen med liknande parametrar. Dessa modeller analyserades för att bestämma värdena för olika hastigheter som skulle ge en ihållande oscillation. Det visade sig att dessa oscillationer gynnades av promotorer kopplade till effektiva ribosombindningsställen , samarbetande transkriptionsrepressorer och jämförbara protein- och mRNA-nedbrytningshastigheter.

Denna analys motiverade två designfunktioner som konstruerades i generna. Först ersattes promotorregioner med en mer effektiv hybridpromotor som kombinerade E. coli fag lambda PL (λ PL) promotor med lac repressor ( Lacl ) och Tet repressor ( TetR ) operatorsekvenser. För det andra, för att minska skillnaden mellan livstiderna för repressorproteinerna och mRNA:n, tillsattes en karboxiterminaltagg baserad på ssrA-RNA-sekvensen vid 3'-änden av varje repressorgen. Denna märkning känns igen av proteaser som riktar sig mot proteinet för nedbrytning. Designen implementerades med användning av en lågkopierad plasmid som kodar för repressilatorn och en reporter med högre kopior, som användes för att transformera en kultur av E. coli .

Naturligt förekommande repressilatorer

Växter

Cirkadiska kretsar i växter har en transkriptionell regulatorisk återkopplingsslinga som kallas repressilatorn. I kärnoscillatorslingan (markerad i grått) i A. thaliana avkänns ljus först av två kryptokromer och fem fytokromer . Två transkriptionsfaktorer, Circadian Clock Associated 1 (CCA1) och Late Elongated Hypocotyl (LHY), undertrycker gener associerade med kvällsuttryck som Timing av CAB-uttryck 1 ( TOC1 ) och aktiverar gener förknippade med morgonuttryck genom att binda till deras promotorer. TOC1 , en kvällsgen, reglerar CCA1 och LHY positivt via en okänd mekanism. Kvällsfas transkriptionsfaktor CCA1 Hiking Expedition (CHE) och histondemetylas jumonji C-domäninnehållande 5 (JMJD5) undertrycker CCA1 direkt . Andra komponenter har visat sig uttryckas under hela dagen och antingen direkt eller indirekt hämmar eller aktiverar ett konsekvent element i dygnskretsen, vilket skapar ett komplext, robust och flexibelt nätverk av återkopplingsslingor.

Uttryck i morgonfas

Uttrycksslingan i morgonfasen hänvisar till de gener och proteiner som reglerar rytmer under dagen i A. thaliana . De två huvudgenerna är LHY och CCA1, som kodar för LHY- och CCA1-transkriptionsfaktorer. Dessa proteiner bildar heterodimerer som kommer in i kärnan och binder till TOC1- genpromotorn, vilket undertrycker produktionen av TOC1-protein. När TOC1-protein uttrycks tjänar det till att reglera LHY och CCA1 genom att hämma deras transkription. Detta stöddes senare 2012 av Dr Alexandra Pokhilo, som använde beräkningsanalyser för att visa att TOC1 tjänade denna roll som en hämmare av LHY- och CCA1 -uttryck. Morgonslingan tjänar till att hämma hypokotylförlängning , i motsats till kvällsfasslingan som främjar hypokotylförlängning. Morgonfasslingan har visat sig vara oförmögen att stödja dygnsrytmoscillation när uttrycksgener i kvällsfas har muterats, vilket tyder på det ömsesidiga beroendet av varje komponent i denna naturligt förekommande repressilator.

Kvällsfasuttryck

Early Flowering 3 ( ELF3 ), Early Flowering 4 ( ELF4 ) och Phytoclock1 ( LUX ) är nyckelelementen i kvällsfasad klockgenuttryck i A. thaliana. De bildar kvällskomplexet, i vilket LUX binder till promotorerna av Phytochrome Interacting Factor 4 ( PIF4 ) och Phytochrome Interacting Factor 5 ( PIF5 ) och hämmar dem. Som ett resultat undertrycks hypokotylförlängning tidigt på kvällen. När hämningen lindras sent på natten förlängs hypokotylen. Fotoperiodblomning styrs av utgående gen Gigantea ( GI ). GI aktiveras på natten och aktiverar uttrycket av Constans ( CO ), vilket aktiverar uttrycket av Flower Locus T ( FT ). FT orsakar sedan blomning under långa dagar.

Däggdjur

Däggdjur utvecklade en endogen tidsmekanism för att koordinera både fysiologi och beteende till 24-timmarsperioden. Under 2016 identifierade forskare en sekvens av tre efterföljande hämningar inom denna mekanism som de identifierade som en repressilator, som nu tros fungera som en viktig kärna i detta dygnsnätverk. Nödvändigheten av detta system fastställdes genom en serie genutslagningar bland kryptokrom ( Cry ), period ( Per ) och Rev-erb - kärndäggdjursklockgener vars knockouts leder till arytmicitet. Modellen som dessa forskare genererade inkluderar Bmal1 som drivkraft för E-box-medierad transkription, Per2 och Cry1 som tidiga respektive sena E-box- repressorer, samt D-box-regulatorn Dbp och nukleärreceptorn Rev-erb-α . De sekventiella hämningarna av Rev-erb , Per och Cry1 kan generera ihållande svängningar, och genom att klämma fast alla andra komponenter förutom denna repressilator kvarstod svängningar med liknande amplituder och perioder. Alla oscillerande nätverk verkar involvera vilken kombination som helst av dessa tre kärngener, vilket visas i olika scheman som släppts av forskare.

Nyligen arbete

Repressilatormodellen har använts för att modellera och studera andra biologiska vägar och system. Sedan dess har ett omfattande arbete med repressilatorns modelleringskapacitet utförts. 2003 utfördes repressilatorns representation och validering av biologiska modeller, som är en modell med många variabler, med hjälp av Simpathica-systemet, som verifierade att modellen verkligen svänger med all dess komplexitet.

Som anges i Elowitz och Leiblers originalverk är det slutliga målet för repressilatorforskning att bygga en konstgjord dygnsrytmklocka som speglar dess naturliga, endogena motsvarighet. Detta skulle innebära att man utvecklar en konstgjord klocka med minskat brus och temperaturkompensation för att bättre förstå dygnsrytmer som kan hittas i livets alla områden . Avbrott i dygnsrytmer kan leda till förlust av rytmicitet i metabola och transkriptionella processer, och till och med påskynda uppkomsten av vissa neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom . Under 2017 skapades oscillatorer som genererade dygnsrytmer och som inte påverkades särskilt mycket av temperaturen i ett laboratorium.

Patologiskt kan repressilatormodellen användas för att modellera celltillväxt och abnormiteter som kan uppstå, såsom de som finns i cancerceller . Genom att göra det kan nya behandlingar utvecklas baserade på dygnsaktivitet hos cancerceller. Dessutom förbättrade en forskargrupp 2016 den tidigare designen av repressilatorn. Efter brus (signalbehandling) flyttade författarna GFP-reporterkonstruktionen till repressilatorplasmiden och tog bort ssrA-nedbrytningstaggarna från varje repressorprotein. Detta förlängde perioden och förbättrade regelbundenheten i repressilatorns svängningar.

Under 2019 främjade en studie Elowitz och Leiblers modell genom att förbättra repressilatorsystemet genom att uppnå en modell med ett unikt steady state och ny hastighetsfunktion. Detta experiment utökade den nuvarande kunskapen om repression och genreglering .

Betydelse

Syntetisk biologi

Konstgjorda repressilatorer upptäcktes genom att implantera en syntetisk hämningsslinga i E. coli . Detta representerade den första implementeringen av syntetiska oscillationer i en organism. Ytterligare implikationer av detta inkluderar möjligheten att rädda muterade komponenter av oscillationer syntetiskt i modellorganismer.

Den artificiella repressilatorn är en milstolpe inom syntetisk biologi som visar att genetiska regulatoriska nätverk kan designas och implementeras för att utföra nya funktioner. Man fann dock att cellernas svängningar drev ur fas efter en tid och den artificiella repressilatorns aktivitet påverkades av celltillväxt. Det första experimentet gav därför ny uppskattning av dygnsklockan som finns i många organismer, eftersom endogena repressilatorer är betydligt mer robusta än implanterade artificiella repressilatorer. Nya undersökningar vid RIKEN Quantitative Biology Center har funnit att kemiska modifieringar av en enda proteinmolekyl kan bilda en temperaturoberoende, självförsörjande oscillator.

Konstgjorda repressilatorer kan potentiellt hjälpa forskning och behandlingar inom områden som sträcker sig från dygnsbiologi till endokrinologi. De kan i allt högre grad visa på synkroniseringen som är inneboende i naturliga biologiska system och de faktorer som påverkar dem.

Cirkadisk biologi

En bättre förståelse för den naturligt förekommande repressilatorn i modellorganismer med endogena dygnstider, som A. thaliana, har tillämpningar inom jordbruket, särskilt när det gäller växtuppfödning och boskapsskötsel.


externa länkar

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Repressilator&oldid=1131296853 "