Native kemisk ligering
Native Chemical Ligation (NCL) är en viktig förlängning av det kemiska ligeringskonceptet för att konstruera en större polypeptidkedja genom kovalent kondensation av två eller flera oskyddade peptidsegment. Nativ kemisk ligering är den mest effektiva metoden för att syntetisera naturliga eller modifierade proteiner av typisk storlek ( dvs proteiner < ~300 AA).
Reaktion
Vid nativ kemisk ligering attackerar den joniserade tiolgruppen av en N-terminal cysteinrest av en oskyddad peptid den C-terminala tioestern av en andra oskyddad peptid, i en vattenhaltig buffert vid pH 7,0 och rumstemperatur. Detta transtioesterifieringssteg är reversibelt i närvaro av en aryltiolkatalysator, vilket gör reaktionen både kemoselektiv och regioselektiv och leder till bildning av en tioesterkopplad mellanprodukt. Mellanprodukten omarrangeras snabbt och spontant genom ett intramolekylärt S,N-acylskifte som resulterar i bildandet av en nativ amidbindning (' peptid ') vid ligeringsstället (schema 1).
Anmärkningar:
- Tioltillsatser:
Det initiala transtioesterifieringssteget av den naturliga kemiska ligeringsreaktionen katalyseras av tioladditiv. Den mest effektiva och vanligaste tiolkatalysatorn är 4-merkaptofenylättiksyra (MPAA), (ref).
Nyckelegenskapen för naturlig kemisk ligering av oskyddade peptider är reversibiliteten av det första steget, tiol(at)-tioesterutbytesreaktionen. Nativ kemisk ligering är utsökt regioselektiv eftersom det tiol(at)-tioesterutbytessteget är fritt reversibelt i närvaro av en tillsatt aryltiolkatalysator. De höga utbyten av slutlig ligeringsprodukt som erhålls, även i närvaro av interna Cys-rester i endera/båda segmenten, är resultatet av irreversibiliteten av det andra (S-till-N acylskift) amidbildande steget under de använda reaktionsbetingelserna .
- Kemoselektivitet för NCL:
Inga biprodukter bildas från reaktion med de andra funktionella grupperna som finns i något av peptidsegmenten (t.ex. Asp, Glu sidokedjekarboxylsyror; Lys epsilon aminogrupp; Tyr fenolisk hydroxyl; Ser, Thr hydroxyler, etc.).
Historiska sammanhang
1992 utvecklade Stephen Kent och Martina Schnölzer vid The Scripps Research Institute konceptet "Chemical Ligation", den första praktiska metoden för att kovalent kondensera oskyddade peptidsegment; nyckelfunktionen för kemisk ligering är bildandet av en onaturlig bindning vid ligeringsstället. Bara två år senare 1994 rapporterade Philip Dawson, Tom Muir och Stephen Kent "Native Chemical Ligation", en utvidgning av det kemiska ligeringskonceptet till bildandet av en naturlig amidbindning ('peptid') efter att initial nukleofil kondensation bildade en tioester- länkad kondensationsprodukt utformad för att spontant omarrangera till den nativa amidbindningen vid ligeringsstället.
Theodor Wieland och medarbetare hade rapporterat S-till-N acylskiftet så tidigt som 1953, när reaktionen av valin -tioester och cysteinaminosyra i vattenhaltig buffert visade sig ge dipeptiden valin-cystein. Reaktionen fortskred genom intermediären av en tioester innehållande svavlet från cysteinåterstoden. Wielands arbete ledde dock INTE till utvecklingen av den naturliga kemiska ligeringsreaktionen. Studiet av aminosyratioesterreaktioner ledde snarare till att Wieland och andra utvecklade den "aktiva ester"-metoden för syntes av skyddade peptidsegment med konventionella kemiska metoder utförda i organiska lösningsmedel.
Funktioner
Nativ kemisk ligering utgör grunden för modern kemisk proteinsyntes och har använts för att framställa många proteiner och enzymer genom total kemisk syntes. Vinsten i den naturliga kemiska ligeringsmetoden är att koppling av långa peptider med denna teknik vanligtvis är nästan kvantitativ och ger syntetisk tillgång till stora peptider och proteiner som annars är omöjliga att göra, på grund av deras stora storlek, dekoration genom post-translationell modifiering, och som innehåller icke -kodad aminosyra eller andra kemiska byggstenar.
Inhemsk kemisk ligering är i sig "grön" i sin atomekonomi och dess användning av godartade lösningsmedel. Det involverar reaktionen av en oskyddad peptidtioester med en andra, oskyddad peptid som har en N-terminal cysteinrest. Den utförs i vattenlösning vid neutralt pH, vanligtvis i 6 M guanidinhydroklorid, i närvaro av en aryltiolkatalysator och ger typiskt nästan kvantitativa utbyten av den önskade ligeringsprodukten.
Peptid-tioestrar kan framställas direkt av Boc chemistry SPPS ; tioesterinnehållande peptider är emellertid inte stabila mot behandling med en nukleofil bas, vilket förhindrar direkt syntes av peptidtioestrar av Fmoc chemistry SPPS . Fmoc kemi fastfas peptidsyntestekniker för att generera peptidtioestrar är baserade på syntesen av peptidhydrazider som omvandlas till peptidtioestrar postsyntetiskt.
Polypeptid C-terminala tioestrar kan också produceras in situ med användning av så kallade N,S -acylskiftsystem. Bis (2-sulfanyletyl)amidogruppen, även kallad SEA-grupp, tillhör denna familj. Polypeptid C-terminala bis (2-sulfanyletyl)amider (SEA-peptidsegment) reagerar med Cys-peptid för att ge en nativ peptidbindning som i NCL. Denna reaktion, som kallas SEA Native Peptide Ligation , är en användbar variant av naturlig kemisk ligering.
Vid framställning av peptidsegment som innehåller en N-terminal cysteinrest bör exponering för ketoner undvikas eftersom dessa kan täcka det N-terminala cysteinet. Använd inte skyddsgrupper som frigör aldehyder eller ketoner . Av samma anledning bör användningen av aceton undvikas, särskilt vid tvätt av glas som används för lyofilisering .
Ett särdrag hos den naturliga kemiska ligeringstekniken är att produktpolypeptidkedjan innehåller cystein vid ligeringsstället. Cysteinet vid ligeringsstället kan avsvavlas till alanin , vilket således utökar intervallet av möjliga ligeringsställen till att inkludera alaninrester. Andra beta-tiol-innehållande aminosyror kan användas för naturlig kemisk ligering, följt av avsvavling. Alternativt kan tiol-innehållande ligeringshjälpmedel användas som efterliknar ett N-terminalt cystein för ligeringsreaktionen, men som kan avlägsnas efter syntes. Användningen av tiolinnehållande hjälpmedel kanske inte är lika effektiv som ligering vid en Cys-rest. Nativ kemisk ligering kan också utföras med en N-terminal selenocysteinrest.
Polypeptid C-terminala tioestrar framställda genom rekombinanta DNA-tekniker kan reageras med en N-terminal Cys-innehållande polypeptid genom samma nativa ligeringskemi för att tillhandahålla mycket stora semisyntetiska proteiner. Nativ kemisk ligering av detta slag med användning av ett rekombinant polypeptidsegment är känt som uttryckt proteinligering. På liknande sätt kan ett rekombinant protein innehållande en N-terminal Cys reageras med en syntetisk polypeptidtioester . Således kan nativ kemisk ligering användas för att introducera kemiskt syntetiserade segment i rekombinanta proteiner, oavsett storlek.
Se även
- ^ Dawson, PE; Muir, TW; Clark-Lewis, I.; Kent, SB (1994). "Syntes av proteiner genom naturlig kemisk ligering". Vetenskap . 266 (5186): 776–778. Bibcode : 1994Sci...266..776D . doi : 10.1126/science.7973629 . PMID 7973629 .
- ^ Agouridas V, El Mahdi O, Diemer V, Cargoët M, Monbaliu JM, Melnyk O (juni 2019). "Nativ kemisk ligering och utökade metoder: mekanismer, katalys, omfattning och begränsningar". Kemiska recensioner . 119 (12): 7328–7443. doi : 10.1021/acs.chemrev.8b00712 . PMID 31050890 . S2CID 145023266 .
- ^ Wieland, T.; Bokelmann, E.; Bauer, L.; Lang, HU; Lau, H (1953). "Über Peptidsynthesen. 8. Mitteilung Bildung von S-haltigen Peptiden durch intramolekulare Wanderung von Aminoacylresten". Liebigs Ann. Chem . 583 : 129-149. doi : 10.1002/jlac.19535830110 .
-
^
Ollivier, N. Dheur, J. Mhidia, R. Blanpain, A. Melnyk, O. (2010). "Bis(2-sulfanyletyl)amino Native Peptide Ligation". Organiska bokstäver . 12 (22): 5238–41. doi : 10.1021/ol102273u . PMID 20964289 .
{{ citera tidskrift }}: CS1 underhåll: flera namn: lista över författare ( länk ) - ^ McGrath, NA; Raines, RT (2011). "Kemoselektivitet i kemisk biologi: Acylöverföringsreaktioner med svavel och selen" . Enl. Chem. Res . 44 (9): 752–761. doi : 10.1021/ar200081s . PMC 3242736 . PMID 21639109 .
Vidare läsning
- Muir TW; Sondhi D.; Cole PA (1998). "Uttryckt proteinligering: En allmän metod för proteinteknik" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 95 (12): 6705–6710. Bibcode : 1998PNAS...95.6705M . doi : 10.1073/pnas.95.12.6705 . PMC 22605 . PMID 9618476 .
- Nilsson BL; Soellner MB; Raines RT (2005). "Kemisk syntes av proteiner" . Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struktur . 34 : 91–118. doi : 10.1146/annurev.biophys.34.040204.144700 . PMC 2845543 . PMID 15869385 .
- Kent SBH (2009). "Total kemisk syntes av proteiner". Chemical Society recensioner . 38 (2): 338–351. doi : 10.1039/B700141J . PMID 19169452 . S2CID 5432012 .
- Conibear AC; Watson EE; Payne RJ; Becker CFW (2018). "Nativ kemisk ligering i proteinsyntes och semisyntes". Chemical Society recensioner . 47 (24): 9046–9068. doi : 10.1039/c8cs00573g . hdl : 2123/22610 . PMID 30418441 .