MikroDNA
MikroDNA är den vanligaste subtypen av extrakromosomalt cirkulärt DNA (eccDNA) hos människor, vanligtvis från 200-400 baspar i längd och berikat med icke-repetitiva genomiska sekvenser med hög densitet av exoner. Dessutom har mikroDNA visat sig komma från regioner med CpG-öar som vanligtvis finns inom 5' och 3' UTR. Eftersom mikroDNA produceras från områden med aktiv transkription, antas det att mikroDNA kan bildas som en biprodukt av reparation av transkriptionell DNA-skada. MikroDNA tros också härröra från andra DNA-reparationsvägar, huvudsakligen på grund av att parentala sekvenser av mikroDNA har 2- till 15 bp direkta upprepningar i ändarna, vilket resulterar i replikationsglidningsreparation. Även om det bara nyligen upptäckts, är den roll som mikroDNA spelar in och ut ur cellen fortfarande inte helt förstått. Emellertid tros mikroDNA för närvarande påverka cellulär homeostas genom transkriptionsfaktorbindning och har använts som en cancerbiomarkör.
Upptäckt
MikroDNA upptäcktes genom protokoll liknande det för eccDNA-extraktion. Specifikt genererades eccDNA-kloner genom multipelförskjutningsamplifiering och sekvenserades med Sanger-sekvensering , vilket ledde till upptäckten av mikroDNA. Nu när sekvensering med hög genomströmning är en mer vanlig praxis, har den fullständiga genomiska sekvensen av däggdjurs eccDNA erhållits genom sekvensering av de rullande amplifieringsprodukterna av eccDNA. Beräkningsmetoder användes sedan för att identifiera kopplingssekvenser i DNA:t. Topparna som hittades vid längder av 180 och 380 bp upptäcktes som mikroDNA och karakteriserades av deras CpG-öar och flankerande 2- till 15 bp direkta upprepningar.
Sedan upptäckten har mikroDNA identifierats i alla vävnadstyper och olika prover, inklusive musvävnader och humana cancercellinjer. Men olika arter har unika genomiska platser som specifikt producerar mikroDNA. Eftersom det finns vanliga genomiska fläckar som producerar mikroDNA i flera cell- och vävnadstyper inom en given art, finns det bevis för att de kanske inte produceras enbart som en biprodukt från DNA-syntes. Studier har emellertid avslöjat separat klustring av mikroDNA extraherat från cellinjer i olika vävnader, vilket tyder på att bildning kan vara kopplad till cellinje och unika transkriptionsmiljöer som finns i olika celltyper.
Biogenes
Även om bildandet av mikroDNA fortfarande är osäkert, har det kopplats till transkriptionsaktivitet och flera DNA-reparationsvägar. Eftersom mikroDNA produceras från områden med hög transkriptionsaktivitet/exondensitet, kan det bildas från DNA-reparation under transkription. Intressant nog tenderar trippelsträngade DNA:RNA-hybrider som bildas under transkription, benämnda R-loopar , att bildas vid CpG-öar inom 5' och 3' UTR, liknande mikroDNA. R-slingor är korrelerade med DNA-skada och genetisk instabilitet, vilket tyder på att mikroDNA kan bildas från den enkelsträngade DNA-slingan (ssDNA) under DNA-skadesvaret för R-loopar.
Vid DNA-replikation av korta direkta upprepningar (som finns i de flankerande regionerna av mikroDNA-genkällor) är det möjligt för DNA-slingor att bildas, på moder- eller produktsträngen, genom replikationsglidning. För att reparera detta missmatch repair (MMR)-vägen ta bort slingan och vid ligering av de upprepade ändarna kan enkelsträngat mikroDNA produceras. ss mikroDNA omvandlas sedan till dubbelsträngat DNA; denna process är fortfarande okänd. Det är viktigt att notera att om slingan bildas på den nyligen replikerade strängen, finns det ingen följddeletion i genomet medan mikrodeletioner kan bildas från utskärningar i mallsträngen. För att förstå vilken roll MMR kan ha i mikroDNA-biogenes, utfördes analys av mikroDNA-överflöd i DT40-celler vid avlägsnande av MSH3 , ett viktigt protein i MMR. Det resulterande mikroDNA:t från DT40 MSH3-/-cellinjen hade en högre anrikning av CpG-öar jämfört med vildtypen samt en över 80 % minskning av dubbelsträngat mikroDNA. Således antas det att MMR-vägen är väsentlig för mikroDNA-produktion från icke-CpG-öar i genomet medan CpG-berikad mikroDNA bildas av en annan reparationsväg.
Återigen, på grund av mikrohomologin på mallgenomet, om det finns ett DNA-avbrott eller en paus i replikationen (replikationsgaffeln stannar), kan det nysyntetiserade DNA:t cirkulera till ss mikroDNA. Detta innebär att när mall-DNA:t repareras efter skapandet av mikroDNA:t finns det ingen deletion.
MikroDNA som skapas genom MMR-vägen och att replikationsgaffeln stannar är ett resultat av fel i DNA-replikeringen, men det finns bevis för att mikroDNA också finns i icke-delande celler. Detta innebär att en del mikroDNA produceras genom reparationsvägar som också förekommer i vilande celler, såsom från 5'-ändar av LINE1- element som är kända för att transponera. För att flytta runt genomet, kräver DNA-transposoner transposas för att avlägsna transposonet från dess ursprungliga plats och katalysera dess införande någon annanstans i genomet. Således skapas transposonet av två dubbelsträngade DNA-avbrott, vilket också skapar en mikrodeletion i DNA:t. Detta dsDNA-fragment kan cirkuleras genom mikrohomologi-medierad cirkularisering, vilket skapar ett ds-mikroDNA.
Implikationer
Transkriptionsfaktorbindning
Eftersom mikroDNA är 200-400 bp långt är det för litet för att koda för proteiner, men de kan vara viktiga för molekylär sponging. Transkriptionsfaktorer binder ofta till promotor- eller regulatoriska sekvenser vid 5'-änden av DNA för att initiera transkription. Dessa transkriptionsfaktorer kan också binda till sina respektive igenkänningsställen på mikroDNA eftersom mikroDNA ofta härstammar från 5' UTR:erna i dess föräldragen, och fungerar därför som en svamp för transkriptionsfaktorer. Detta innebär att mikroDNA indirekt kan kontrollera genuttryck och transkriptionshomeostas.
Cancerapplikationer
Generellt sett är nukleinsyramolekyler som finns i blodomloppet, kallade cirkulerande eller cellfria, en relativt ny sjukdomsbiomarkör som undersöks, inklusive för diagnos och progression av cancer. Dessa molekyler, såsom cellfritt DNA (cfDNA), frisätts i blodet vid celldöd och kan i fall av cancer identifieras utifrån de kända mutationerna i onkogener.
Nyligen genomförda studier har utökat användningen av cellfria nukleinsyror som cancerbiomarkörer till mikroDNA. cfmicroDNA erhölls från humant och musserum och på grund av deras likheter med cellhärlett mikroDNA, såsom beskrivits ovan, drogs slutsatsen att cfmicroDNA produceras i cellen. På liknande sätt, när man jämförde lungvävnad före och efter tumörborttagning, fanns det ingen skillnad i cirkulerande mikroDNA-nyckelegenskaper förutom en oväntad trend av längre cirkulerande mikroDNA-sekvenser hos cancerpatienter före tumörborttagning. Längden av cfmicroDNA visade sig vara kortare efter operationen.
Cellfritt DNA rensas snabbt från blodet, vilket gör det till en svår biomarkör för cancer. Men eftersom cirkulärt DNA inte är mottagligt för DNA-brott av RNAse och exonukleas , är det mer stabilt än linjärt DNA. I kombination med den observerade förlängningen av cfmicroDNA i cancerpatientserum gör detta cirkulerande mikroDNA till en bra cancerbiomarkör för både diagnos och progression efter behandling.