Mallbytande polymeraskedjereaktion

Template-switching polymerase chain reaction ( TS-PCR ) är en metod för omvänd transkription och polymeraskedjereaktion (PCR) amplifiering som bygger på en naturlig PCR-primersekvens vid polyadenyleringsstället , även känd som poly(A)-svansen, och lägger till en andra primer genom aktiviteten av murint leukemivirus omvänt transkriptas . Detta tillåter läsning av fullständiga cDNA- sekvenser och kan leverera högt utbyte från enstaka källor, även enstaka celler som innehåller 10 till 30 pikogram mRNA , med relativt låga nivåer (3-5% ) av kontaminerande rRNA -sekvens. Denna teknik används ofta i hel transkriptom hagelgevärssekvensering . Den marknadsförs av Clontech som Switching Mechanism At the 5' end of RNA Template ( SMART ) samt av Diagenode som Capture and Amplification by Tailing and Switching ( CATS ) .

Drop-Seq

Genom att använda sprutpumpar för att överföra en jämn hastighet av isolerade celler och unikt oligonukleotidstreckkodade pärlor, är det möjligt att isolera enskilda celler och pärlor tillsammans i droppar av lysbuffert, där polyadenyleringsstället binder till en primer som innehåller en unik, identifierande sekvens . Denna primer innehåller också en gemensam sekvens uppströms om identifieraren, så att efter att den har förlängts genom omvänd transkription kommer efterföljande omgångar av PCR att inkorporera taggen, vilket gör att varje isolerat cDNA som sekvenseras kan spåras tillbaka till en specifik ursprungspärla. Detta tillåter att de relativa nivåerna av transkript i många individuella celler analyseras samtidigt, vilket skapar en rationell grund för klassificeringen av dessa celler i särskilda celltyper, eller tillåter den logiska slutsatsen av in situ hybridiseringsdata från embryon utan att faktiskt utföra experimentet.