Magnetisk pincett

Magnetisk pincett (MT) är vetenskapliga instrument för manipulation och karakterisering av biomolekyler eller polymerer . Dessa apparater utövar krafter och vridmoment på enskilda molekyler eller grupper av molekyler. Den kan användas för att mäta draghållfastheten eller kraften som genereras av molekyler.

Oftast används magnetisk pincett för att studera mekaniska egenskaper hos biologiska makromolekyler som DNA eller proteiner i experiment med en enda molekyl . Andra tillämpningar är mjuk materias reologi och studier av kraftreglerade processer i levande celler. Krafter är vanligtvis i storleksordningen pico- till nanonewton (pN till nN). På grund av sin enkla arkitektur är magnetpincett ett populärt biofysiskt verktyg.

I experiment är molekylen av intresse fäst vid en magnetisk mikropartikel. Den magnetiska pincetten är utrustad med magneter som används för att manipulera de magnetiska partiklarna vars position mäts med hjälp av videomikroskopi.

Konstruktionsprincip och fysik för magnetisk pincett

En magnetisk pincettapparat består av magnetiska mikropartiklar, som kan manipuleras med hjälp av ett externt magnetfält. De magnetiska partiklarnas position bestäms sedan av ett mikroskopiskt objektiv med en kamera.

Molecule attached to a tethering surface and a magnetic bead. The bead is placed in a magnetic field gradient that exerts a force on the bead.
Typisk konfiguration för magnetisk pincett; endast den experimentella volymen visas.

Magnetiska partiklar

Magnetiska partiklar för användning i magnetisk pincett kommer med ett brett utbud av egenskaper och måste väljas enligt den avsedda användningen. Två grundläggande typer av magnetiska partiklar beskrivs i följande stycken; men det finns också andra som magnetiska nanopartiklar i ferrofluids , som tillåter experiment inuti en cell.

Superparamagnetiska pärlor

Superparamagnetiska pärlor finns kommersiellt tillgängliga med ett antal olika egenskaper. Det vanligaste är användningen av sfäriska partiklar med en diameter i mikrometerområdet. De består av en porös latexmatris i vilken magnetiska nanopartiklar har bäddats in. Latex är autofluorescerande och kan därför vara fördelaktigt för avbildning av deras position. Oregelbundet formade partiklar uppvisar en större yta och därmed en högre sannolikhet att binda till de molekyler som ska studeras. Beläggningen av mikropärlorna kan också innehålla ligander som kan fästa molekylerna av intresse. Till exempel kan beläggningen innehålla streptavidin som kopplar starkt till biotin , som i sig kan vara bundet till molekylerna av intresse.

När de utsätts för ett externt magnetfält blir dessa mikropärlor magnetiserade. Det inducerade magnetiska momentet är proportionellt mot ett svagt externt magnetfält :

där är vakuumpermeabiliteten . Det är också proportionellt mot volymen av mikrosfärerna , vilket härrör från det faktum att antalet magnetiska nanopartiklar skalar med storleken på pärlan. Den magnetiska susceptibiliteten antas vara skalär i denna första uppskattning och kan beräknas med , där är den relativa permeabiliteten . I ett starkt yttre fält mättas det inducerade magnetiska momentet vid ett materialberoende värde . Kraften som upplevs av en mikropärla kan härledas från potentialen av detta magnetiska moment i ett yttre magnetfält:

Det yttre magnetfältet kan utvärderas numeriskt med hjälp av finita elementanalys eller genom att helt enkelt mäta magnetfältet med hjälp av en Halleffektsensor . Teoretiskt skulle det vara möjligt att beräkna kraften på pärlorna med dessa formler; resultaten är dock inte särskilt tillförlitliga på grund av osäkerheter hos de inblandade variablerna, men de tillåter skattning av storleksordningen och hjälper till att bättre förstå systemet. Mer exakta numeriska värden kan erhållas med tanke på pärlornas Brownska rörelse .

På grund av anisotropier i den stokastiska fördelningen av nanopartiklarna i mikropärlan är det magnetiska momentet inte perfekt i linje med det yttre magnetfältet, dvs. den magnetiska känslighetstensorn kan inte reduceras till en skalär. Av denna anledning utsätts kulorna också för ett vridmoment som försöker rikta in och :

Vridmomenten som genereras med denna metod är vanligtvis mycket större än vilket är mer än nödvändigt för att vrida molekylerna av intresse.

Ferromagnetiska nanotrådar

Användningen av ferromagnetiska nanotrådar för drift av magnetiska pincett utökar deras experimentella tillämpningsområde. Längden på dessa trådar är vanligtvis i storleksordningen tiotals nanometer upp till tiotals mikrometer, vilket är mycket större än deras diameter. I jämförelse med superparamagnetiska pärlor tillåter de applicering av mycket större krafter och vridmoment. Utöver det presenterar de ett kvarvarande magnetiskt ögonblick. Detta möjliggör operation i svaga magnetiska fältstyrkor. Det är möjligt att producera nanotrådar med ytsegment som uppvisar olika kemiska egenskaper, vilket gör det möjligt att kontrollera positionen där de studerade molekylerna kan binda till tråden.

Magneter

För att kunna utöva vridmoment på mikropärlorna krävs minst två magneter, men många andra konfigurationer har realiserats, från endast en magnet som bara drar de magnetiska mikropärlorna till ett system med sex elektromagneter som tillåter fullständig kontroll av den 3-dimensionella positionen och rotation via en digital återkopplingsslinga . Magnetfältets styrka minskar ungefär exponentiellt med avståndet från axeln som förbinder de två magneterna på en typisk skala av ungefär bredden av gapet mellan magneterna. Eftersom denna skala är ganska stor i jämförelse med avstånden, när mikropärlan rör sig i ett experiment, kan kraften som verkar på den behandlas som konstant. Därför är magnetisk pincett passiva kraftklämmor på grund av deras konstruktion i motsats till optiska pincett, även om de också kan användas som positiva klämmor i kombination med en återkopplingsslinga. Fältstyrkan kan ökas genom att skärpa magnetens polyta, vilket dock också minskar området där fältet kan anses vara konstant. En järnring anslutning magneternas yttre poler kan hjälpa till att minska ströfält. Magnetisk pincett kan manövreras med både permanentmagneter och elektromagneter. De två teknikerna har sina specifika fördelar.

Permanenta magneter

Permanenta magneter på magnetisk pincett är vanligtvis av sällsynta jordartsmetaller, som neodym , och kan nå fältstyrkor som överstiger 1,3 Tesla. Kraften på pärlorna kan kontrolleras genom att förflytta magneterna längs den vertikala axeln. Om du flyttar dem uppåt minskar fältstyrkan vid pärlans position och vice versa. Vridmoment på de magnetiska pärlorna kan utövas genom att vrida magneterna runt den vertikala axeln för att ändra fältets riktning. Storleken på magneterna är i storleksordningen millimeter samt deras avstånd.

Elektromagneter

Användningen av elektromagneter i magnetisk pincett har fördelen att fältstyrkan och riktningen kan ändras bara genom att justera amplituden och fasen för strömmen för magneterna. Av denna anledning behöver magneterna inte flyttas vilket möjliggör en snabbare kontroll av systemet och minskar mekaniskt brus. För att öka den maximala fältstyrkan kan en kärna av ett mjukt paramagnetiskt material med hög mättnad och låg remanens läggas till solenoiden. I vilket fall som helst är emellertid de typiska fältstyrkorna mycket lägre jämfört med permanentmagneter av jämförbar storlek. Användning av elektromagneter kräver dessutom höga strömmar som producerar värme som kan kräva ett kylsystem.

Pärlspårningssystem

Förskjutningen av de magnetiska pärlorna motsvarar systemets svar på det pålagda magnetfältet och måste därför mätas exakt: I en typisk uppställning belyses experimentvolymen från toppen så att pärlorna producerar diffraktionsringar i fokalplanet för ett objektiv som är placerat under förbindningsytan. Diffraktionsmönstret registreras sedan av en CCD-kamera . Bilden kan analyseras i realtid av en dator. Detekteringen av positionen i tjuderytans plan är inte komplicerad eftersom den motsvarar mitten av diffraktionsringarna. Precisionen kan vara upp till några nanometer. För positionen längs den vertikala axeln måste diffraktionsmönstret jämföras med referensbilder, som visar diffraktionsmönstret för den betraktade pärlan i ett antal kända avstånd från fokalplanet. Dessa kalibreringsbilder erhålls genom att hålla en pärla fixerad samtidigt som man förskjuter objektivet, dvs fokalplanet, med hjälp av piezoelektriska element med kända avstånd. Med hjälp av interpolation kan upplösningen nå en precision på upp till 10 nm längs denna axel. De erhållna koordinaterna kan användas som indata för en digital återkopplingsslinga som styr magnetfältets styrka, till exempel för att hålla kulan i en viss position.

Icke-magnetiska pärlor läggs vanligtvis också till provet som en referens för att tillhandahålla en bakgrundsförskjutningsvektor. De har en annan diameter som de magnetiska pärlorna så att de är optiskt urskiljbara. Detta är nödvändigt för att upptäcka potentiell drift av vätskan. Till exempel, om densiteten av magnetiska partiklar är för hög, kan de dra med sig den omgivande trögflytande vätskan. Förskjutningsvektorn för en magnetisk pärla kan bestämmas genom att subtrahera dess initiala positionsvektor och denna bakgrundsförskjutningsvektor från dess nuvarande position.

Kraftkalibrering

Bestämningen av kraften som utövas av magnetfältet på de magnetiska pärlorna kan beräknas med hänsyn till termiska fluktuationer hos pärlan i horisontalplanet: Problemet är rotationssymmetriskt med avseende på den vertikala axeln; härefter kallas en godtyckligt utvald riktning i symmetriplanet . Analysen är densamma för riktningen ortogonal mot x-riktningen och kan användas för att öka precisionen. Om pärlan lämnar sin jämviktsposition på -axeln med på grund av termiska fluktuationer, kommer den att utsättas för en återställande kraft som ökar linjärt med i första ordningens approximation. Med tanke på endast absoluta värden för de inblandade vektorerna är det geometriskt tydligt att proportionalitetskonstanten är kraften som utövas av magneterna över längden av molekylen som håller pärlan förankrad vid tjudytan :

Magnetic bead anchored to a surface by a molecule of length l. It is pulled up by a force F and if deviated horizontally by thermal fluctuations by delta x an additional restoring force F_r acts on the bead.
Geometri för krafterna som verkar på den magnetiska pärlan.

.

Ekvipartitionssatsen säger att medelenergin som lagras i denna "fjäder" är lika med per frihetsgrad. Eftersom endast en riktning beaktas här, lyder systemets potentiella energi: . Från detta kan en första uppskattning av kraften som verkar på strängen härledas:

.

För en mer exakt kalibrering är dock en analys i Fourierrymden nödvändig. Effektspektrumdensiteten för pärlans position är experimentellt tillgänglig . Ett teoretiskt uttryck för detta spektrum härleds i det följande, som sedan kan anpassas till den experimentella kurvan för att erhålla kraften som magneterna utövar på kulan som en passningsparameter. Per definition är detta spektrum den kvadratiska modulen för Fouriertransformen av positionen över den spektrala bandbredden :

kan erhållas med tanke på rörelseekvationen för en pärla med massa :

Termen motsvarar Stokes friktionskraft för en sfärisk partikel med radie i ett medium med viskositet och är den återställande kraften som är emot den stokastiska kraften på grund av den Brownska rörelsen. Här kan man försumma tröghetstermen eftersom systemet är i en regim med mycket lågt Reynolds tal .

Rörelseekvationen kan Fouriertransformeras genom att infoga drivkraften och positionen i Fourierrymden:

Det här leder till:

.

Effektspektraltätheten för den stokastiska kraften kan härledas genom att använda ekvipartitionssatsen och det faktum att Brownska kollisioner är helt okorrelerade:

Detta motsvarar fluktuationsförlustsatsen . Med det uttrycket är det möjligt att ge ett teoretiskt uttryck för effektspektrumet:

Det enda okända i detta uttryck, , kan bestämmas genom att anpassa detta uttryck till det experimentella effektspektrumet. För mer exakta resultat kan man subtrahera effekten på grund av ändlig kameraintegreringstid från det experimentella spektrumet innan man gör passningen.

En annan kraftkalibreringsmetod är att använda mikropärlornas viskösa drag: Därför dras mikropärlorna genom det trögflytande mediet medan de registrerar deras position. Eftersom Reynolds-talet för systemet är mycket lågt, är det möjligt att tillämpa Stokes lag för att beräkna friktionskraften som är i jämvikt med kraften som utövas av magneterna:

.

Hastigheten kan bestämmas genom att använda de inspelade hastighetsvärdena. Den kraft som erhålls via denna formel kan sedan relateras till en given konfiguration av magneterna, som kan fungera som en kalibrering.

Typisk experimentuppställning

Three schematic torsion-extension curves of a DNA molecule at different stretching forces. For the lowest force, the extension shrinks for both, positive and negative torsion and the curve is symmetric for the positive and negative torsion branch. For intermediate forces, the extension diminishes only for positive turns and for the highest forces it stays constant. The number of turns is in the order of hundreds, and the extension is typically in the order of micrometers.
Schematiska torsionsförlängningskurvor av DNA vid olika krafter i pico Newton-området.

Detta avsnitt ger ett exempel på ett experiment utfört av Strick, Allemand, Croquette med hjälp av magnetpincett. En dubbelsträngad DNA-molekyl är fixerad med flera bindningsställen i ena änden till en glasyta och på den andra till en magnetisk mikropärla, som kan manipuleras i en magnetisk pincett. Genom att vrida magneterna kan vridpåkänning appliceras på DNA-molekylen. Rotationer i betydelsen av DNA-helixen räknas positivt och vice versa. Medan den vrids tillåter den magnetiska pincetten också att sträcka ut DNA-molekylen. På detta sätt kan torsionsförlängningskurvor registreras vid olika sträckkrafter. För låga krafter (mindre än cirka 0,5 pN) bildar DNA:t superspolar, så kallade plectonemes, som minskar förlängningen av DNA-molekylen ganska symmetriskt för positiva och negativa vridningar. Att öka dragkraften ökar redan förlängningen för noll pålagd vridning. Positiva vridningar leder återigen till plexonemebildning som minskar förlängningen. Negativ twist förändrar dock inte förlängningen av DNA-molekylen mycket. Detta kan tolkas som separationen av de två strängarna som motsvarar denatureringen av molekylen. I högkraftsregimen är förlängningen nästan oberoende av den applicerade vridspänningen. Tolkningen är uppenbarelsen av lokala regioner med starkt översvårigt DNA. En viktig parameter i detta experiment är också lösningens jonstyrka som påverkar de kritiska värdena för den applicerade dragkraften som skiljer de tre kraftregimerna åt.

Historia och utveckling

Crick vid Cambridge University

Att tillämpa magnetisk teori på studiet av biologi är en biofysisk teknik som började dyka upp i Tyskland i början av 1920-talet. Möjligen publicerades den första demonstrationen av Alfred Heilbronn 1922; hans arbete tittade på viskositeten hos protoplaster . Följande år utforskade Freundlich och Seifriz reologi i tagghudsägg . Båda studierna inkluderade införande av magnetiska partiklar i celler och resulterande rörelseobservationer i en magnetfältsgradient .

Dr Fell vid hennes labb i Cambridge på 1950-talet

1949 vid Cambridge University demonstrerade Francis Crick och Arthur Hughes en ny användning av tekniken och kallade den "The Magnetic Particle Method". Tanken, som ursprungligen kom från Dr. Honor Fell , var att små magnetiska pärlor, fagocyterade av hela celler odlade i kultur, kunde manipuleras av ett externt magnetfält. Vävnadskulturen fick växa i närvaro av det magnetiska materialet, och celler som innehöll en magnetisk partikel kunde ses med ett högeffektmikroskop. När den magnetiska partikeln fördes genom cellen av ett magnetfält gjordes mätningar om cytoplasmans fysikaliska egenskaper. Även om vissa av deras metoder och mätningar var självklart grova, visade deras arbete användbarheten av magnetfältspartikelmanipulation och banade väg för vidareutveckling av denna teknik. Den magnetiska partikelfagocytosmetoden fortsatte att användas under många år för att undersöka cytoplasmans reologi och andra fysikaliska egenskaper hos hela celler.

En innovation på 1990-talet ledde till en expansion av teknikens användbarhet på ett sätt som liknade den då framväxande optiska pincettmetoden . Kemisk koppling av en individuell DNA-molekyl mellan en magnetisk pärla och en glasskiva gjorde det möjligt för forskare att manipulera en enda DNA-molekyl med ett externt magnetfält. Vid applicering av vridkrafter på molekylen kunde avvikelser från friformsrörelse mätas mot teoretiska standardkraftkurvor eller Brownsk rörelseanalys. Detta gav insikt i strukturella och mekaniska egenskaper hos DNA, såsom elasticitet .

Magnetisk pincett som en experimentell teknik har blivit exceptionellt varierande i användning och tillämpning. På senare tid har införandet av ännu fler nya metoder upptäckts eller föreslagits. Sedan 2002 har potentialen för experiment som involverar många tjudrande molekyler och parallella magnetiska pärlor undersökts, vilket belyser interaktionsmekaniken, särskilt när det gäller DNA-bindande proteiner . En teknik publicerades 2005 som involverade beläggning av en magnetisk pärla med en molekylär receptor och glasskivan med sin ligand . Detta möjliggör en unik titt på receptor-ligand-dissociationskraft. 2007 utvecklades en ny metod för magnetisk manipulering av hela celler av Kollmannsberger och Fabry. Tekniken innebär att man fäster pärlor på den extracellulära matrisen och manipulerar cellen från utsidan av membranet för att titta på strukturell elasticitet. Denna metod fortsätter att användas som ett sätt att studera reologi , såväl som cellulära strukturella proteiner . En studie dök upp i en 2013 som använde magnetisk pincett för att mekaniskt mäta avlindningen och återspolningen av ett enda neuronalt SNARE -komplex genom att binda hela komplexet mellan en magnetisk pärla och objektglaset och sedan använda den applicerade magnetfältskraften för att dra isär komplexet.

Biologiska tillämpningar

Magnetisk pincett reologi

Magnetisk pincett kan användas för att mäta mekaniska egenskaper såsom reologi , studiet av materiaflöde och elasticitet, i hela celler. Den fagocytosmetoden är användbar för att fånga en magnetisk pärla inuti en cell. Mätning av pärlornas rörelse inuti cellen som svar på manipulation från det externa magnetfältet ger information om den fysiska miljön inuti cellen och inre medias reologi: cytoplasmans viskositet, styvheten i den inre strukturen och lätt partikelflöde.

En hel cell kan också magnetiskt manipuleras genom att fästa en magnetisk pärla till den extracellulära matrisen via fibronektinbelagda magnetiska pärlor. Fibronektin är ett protein som kommer att binda till extracellulära membranproteiner . Denna teknik möjliggör mätningar av cellstyvhet och ger insikter om hur strukturella proteiner fungerar. Schemat som visas till höger visar den experimentella uppställningen som utformats av Bonakdar och Schilling, et al. (2015) för att studera det strukturella proteinet pektin i musceller. Styvhet mättes som proportionell mot kulans position som svar på extern magnetisk manipulation.

Experiment med en molekyl

Magnetisk pincett som en molekylmetod är definitivt den vanligaste användningen på senare år. Genom enkelmolekylmetoden ger molekylär pincett en närmare titt på de fysiska och mekaniska egenskaperna hos biologiska makromolekyler . I likhet med andra enmolekylära metoder, såsom optisk pincett , ger denna metod ett sätt att isolera och manipulera en enskild molekyl fri från påverkan av omgivande molekyler. Här är den magnetiska pärlan fäst vid en tjudrande yta av molekylen av intresse. DNA eller RNA kan tjudras i antingen enkelsträngad eller dubbelsträngad form, eller hela strukturella motiv kan tjudras, såsom DNA Holliday-övergångar , DNA-hårnålar eller hela nukleosomer och kromatin . Genom att verka på den magnetiska pärlan med magnetfältet kan olika typer av torsionskraft appliceras för att studera intra-DNA-interaktioner, såväl som interaktioner med topoisomeraser eller histoner i kromosomer .

Enkelkomplexa studier

Magnetisk pincett går utöver kapaciteten hos andra enmolekylära metoder, dock genom att interaktioner mellan och inom komplex också kan observeras. Detta har möjliggjort nya framsteg när det gäller att förstå mer om DNA-bindande proteiner , receptor-ligand-interaktioner och restriktionsenzymklyvning. En nyare användning av magnetisk pincett ses i enkelkomplexstudier. Med hjälp av DNA som bindemedel kan ett helt molekylärt komplex fästas mellan kulan och bindningsytan. På exakt samma sätt som att dra isär en DNA-hårnål genom att applicera en kraft på den magnetiska pärlan, kan ett helt komplex dras isär och kraft som krävs för dissociationen kan mätas. Detta liknar också metoden att dra isär receptor-ligand-interaktioner med magnetisk pincett för att mäta dissociationskraften.

Jämförelse med andra tekniker

Detta avsnitt jämför egenskaperna hos magnetisk pincett med egenskaperna hos de viktigaste andra experimentella metoderna med en molekyl: optisk pincett och atomkraftsmikroskopi . Den magnetiska interaktionen är mycket specifik för de använda superparamagnetiska mikropärlorna. Magnetfältet påverkar praktiskt taget inte provet. Optisk pincett har problemet att laserstrålen också kan interagera med andra partiklar i det biologiska provet på grund av kontraster i brytningsindex . Utöver det kan lasern orsaka fotoskador och provuppvärmning. När det gäller atomkraftsmikroskopi kan det också vara svårt att skilja spetsens interaktion med den studerade molekylen från andra ospecifika interaktioner.

Tack vare den låga fällstyvheten är kraftomfånget som är tillgängligt med magnetisk pincett lägre jämfört med de två andra teknikerna. Möjligheten att utöva vridmoment med magnetisk pincett är inte unik: optisk pincett kan också erbjuda denna funktion när den används med dubbelbrytande mikropärlor i kombination med en cirkulärt polariserad laserstråle.

En annan fördel med magnetpincett är att det är lätt att parallellt utföra många enstaka molekylmätningar.

En viktig nackdel med magnetisk pincett är den låga tidsmässiga och rumsliga upplösningen på grund av datainsamlingen via videomikroskopi. Men med tillägget av en höghastighetskamera har den tidsmässiga och rumsliga upplösningen visat sig nå ångströmsnivån.

Vidare läsning