Märkningsfri kvantifiering

Märkningsfri kvantifiering är en metod inom masspektrometri som syftar till att bestämma den relativa mängden proteiner i två eller flera biologiska prover. Till skillnad från andra metoder för proteinkvantifiering använder märkningsfri kvantifiering inte en stabil isotopinnehållande förening för att kemiskt binda till och därmed märka proteinet.

Genomförande

Etikettfritt kvantifieringsexperiment med 3 prover, 3 LC-MS-filer och 5 prekursorjoner/peptider. Intensiteter vid toppen av de kromatografiska topparna används för kvantifiering i detta speciella fall. Peptider identifieras via fragmenteringsmasspektra, och några av prekursorjonerna kommer att kvantifieras, men inte mappas till någon peptidsekvens.

Märkningsfri kvantifiering kan baseras på prekursorsignalintensitet eller på spektralräkning . Den första metoden är användbar när den tillämpas på masspektra med hög precision, såsom de som erhålls med den nya generationen av flygtid (ToF), Fourier-transformjoncyklotronresonans (FTICR) eller Orbitrap -massanalysatorer. Den högupplösta kraften underlättar extraheringen av peptidsignaler på MS ¹ -nivån och frikopplar således kvantifieringen från identifieringsprocessen. Däremot räknar spektralräkning helt enkelt antalet spektra som identifierats för en given peptid i olika biologiska prover och integrerar sedan resultaten för alla uppmätta peptider av proteinet/proteinerna som kvantifieras.

Det beräkningsmässiga ramverket för etikettfri tillvägagångssätt inkluderar detektering av peptider, matchning av motsvarande peptider över flera LC-MS-data, val av diskriminerande peptider.

Intakt proteinexpressionsspektrometri (IPEx) är en etikettfri kvantifieringsmetod inom masspektrometri under utveckling av den analytiska kemigruppen vid United States Food and Drug Administration Center for Food Safety and Applied Nutrition och på andra ställen. Intakta proteiner analyseras med ett LCMS- instrument, vanligtvis en fyrpolig flygtid i profilläge, och hela proteinprofilen bestäms och kvantifieras med hjälp av programvara för datareduktion. Tidiga resultat är mycket uppmuntrande. I en studie visar två grupper av behandlingsreplikat från däggdjursprover (olika organismer med liknande behandlingshistorik, men inte tekniska replikat) dussintals biomarkörer för lågt CV-protein, vilket tyder på att IPEx är en användbar teknologi för att studera proteinuttryck.

Detektering av peptider

Typiskt detekteras peptidsignaler på MS1-nivån och särskiljs från kemiskt brus genom deras karakteristiska isotopmönster. Dessa mönster spåras sedan över retentionstidsdimensionen och används för att rekonstruera en kromatografisk elueringsprofil för den monoisotopiska peptidmassan. Den totala jonströmmen för peptidsignalen integreras sedan och används som en kvantitativ mätning av den ursprungliga peptidkoncentrationen. För varje detekterad peptid hittas först alla isotoptoppar och laddningstillståndet tilldelas sedan.

Märkningsfri kvantifiering kan baseras på prekursorsignalintensitet och har problem på grund av isoleringsinterferens: i studier med hög genomströmning kan identiteten för den peptidprekursorjon som mäts lätt vara en helt annan peptid med ett liknande m/z-förhållande och som eluerar inom en tidsram som överlappar den för den tidigare peptiden. Spektralräkning har problem på grund av att peptiderna identifieras, vilket gör det nödvändigt att köra ytterligare en MS/MS-skanning som tar tid och därför minskar upplösningen av experimentet.

Matchande motsvarande peptider

I motsats till differentiell märkning måste varje biologiskt prov mätas separat i ett etikettfritt experiment. De extraherade peptidsignalerna kartläggs sedan över få eller flera LC-MS-mätningar med hjälp av deras koordinater på dimensionerna massa-till-laddning och retentionstid. Data från högmassprecisionsinstrument underlättar i hög grad denna process och ökar säkerheten för att matcha korrekta peptidsignaler över körningar.

Det är klart att differentiell bearbetning av biologiska prover gör det nödvändigt att ha en standard som kan användas för att justera resultaten. Peptider som inte förväntas förändras i sina uttrycksnivåer i olika biologiska prover kan användas för detta ändamål. Alla peptider joniseras dock inte bra och därför bör valet av kandidater göras efter en initial studie som endast ska karakterisera proteininnehållet i de biologiska prover som kommer att undersökas.

Val av diskriminerande peptider

Slutligen används sofistikerade normaliseringsmetoder för att ta bort systematiska artefakter i peptidintensitetsvärdena mellan LC-MS-mätningar. Sedan identifieras diskriminerande peptider genom att välja de peptider vars normaliserade intensiteter är olika (t.ex. p-värde < 0,05) bland flera grupper av prover.

Dessutom erbjuder nyare hybridmasspektrometrar som LTQ OrbiTrap möjligheten att förvärva MS/MS-peptididentifikationer parallellt med hög massprecisionsmätning av peptider på MS1-nivå. Detta väcker beräkningsutmaningen för bearbetning och integration av dessa två informationskällor och har lett till utvecklingen av nya lovande kvantifieringsstrategier.