Isobarisk märkning

Ett schema över isobarisk märkning: proteiner extraheras från olika tillstånd eller celltyper, spjälkas till peptider och märks med isobariska stabila isotoptaggar. Dessa taggar består av reporter-, balans- och reaktiva regioner. Lättare reporterregioner paras med tyngre balansregioner, så att hela taggen fäst vid peptiden lägger till samma massförskjutning. Därför, efter blandning, i MS ¹ , uppträder peptiderna som en enda prekursor. Men när de fragmenteras under MS2 ^, förutom de normala fragmentjonerna, dissocierar reporterregionerna för att producera jonsignaler som tillhandahåller kvantitativ information om den relativa mängden av peptiden i proverna.

Isobarisk märkning är en masspektrometristrategi som används i kvantitativ proteomik . Peptider eller proteiner är märkta med kemiska grupper som har (åtminstone nominellt) identisk massa (isobar), men som varierar vad gäller fördelning av tunga isotoper i deras struktur. Dessa taggar, vanligen kallade tandemmasstaggar, är utformade så att masstaggen klyvs vid en specifik länkregion vid högenergi- CID (HCD) under tandemmasspektrometri som ger reporterjoner av olika massor. De vanligaste isobariska taggar är aminreaktiva taggar. Emellertid har taggar som reagerar med cysteinrester och karbonylgrupper också beskrivits. Dessa aminreaktiva grupper går igenom N-hydroxisuccinimid (NHS) reaktioner, som är baserade på tre typer av funktionella grupper. Isobariska märkningsmetoder inkluderar tandemmasstaggar (TMT) , isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering (iTRAQ), massdifferentiella taggar för absolut och relativ kvantifiering och dimetylmärkning. TMT och iTRAQ-metoder är vanligast och utvecklade av dessa metoder. Tandemmasstaggar har en massreporterregion, en klyvbar länkregion, en massnormaliseringsregion och en proteinreaktiv grupp och har samma totala massa.

Arbetsflöde

Ett typiskt bottom-up- arbetsflöde för proteomik beskrivs av (Yates, 2014). Proteinprover smälts enzymatiskt av ett proteas för att producera peptider. Varje smält experimentellt prov är derivat med en annan isotopvariant av taggen från en uppsättning. Proverna blandas i typiskt lika förhållanden och analyseras samtidigt i en MS-körning. Eftersom taggarna är isobariska och har identiska kemiska egenskaper, visas de isotopiska varianterna av taggarna som en enda sammansatt topp vid samma m/z-värde i en MS1-skanning med identiska retentionstider för vätskekromatografi (LC). Under en vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS)-analys producerar de fragmenterade peptiderna sekvensspecifika produktjoner. Dessa produktjoner används för att bestämma peptidsekvensen och reportertaggarna vars mängder återspeglar det relativa förhållandet mellan peptiden i proverna som kombinerades. Användningen av MS/MS krävs för att detektera taggarna, därför kvantifieras inte omärkta peptider.

Proteomiskt arbetsflöde för isobar märkning med 4 unika reagenser i en uppsättning och 7 olika biologiska prover kombinerade till 2 märkningsgrupper (plex). Eftersom antalet prover är högre än antalet reagenser bör märkningen utföras i två omgångar.

Fördelar

Förklarat tidigare av (Lee, Choe, Aggarwal, 2017). En viktig fördel med isobarisk märkning jämfört med andra kvantifieringstekniker (t.ex. etikettfri) är multiplexfunktionerna och därmed ökad genomströmningspotential. Möjligheten att kombinera och analysera flera prover samtidigt i en LC-MS-körning eliminerar behovet av att analysera flera datamängder och eliminerar kör-till-körning. Multiplexering minskar provbearbetningsvariabiliteten, förbättrar specificiteten genom att kvantifiera peptiderna från varje tillstånd samtidigt och minskar omloppstiden för flera prover. Utan multiplexering kan information missas från körning till körning, vilket påverkar identifiering och kvantifiering, eftersom peptider som valts ut för fragmentering på en LC-MS/MS-körning kanske inte finns närvarande eller av lämplig kvantitet i efterföljande provkörningar. De nuvarande tillgängliga isobariska kemiska taggar underlättar samtidig analys av 2 till 11 experimentella prover.

Ansökningar

ITRAQ 8plex kit

Isobarisk märkning har framgångsrikt använts för många biologiska tillämpningar inklusive proteinidentifiering och kvantifiering, proteinuttrycksprofilering av normala vs onormala tillstånd, kvantitativ analys av proteiner för vilka inga antikroppar finns tillgängliga och identifiering och kvantifiering av posttranslationsmodifierade proteiner.

Tillgänglighet

Det finns två typer av isobariska taggar kommersiellt tillgängliga: tandemmasstaggar (TMT) och isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering (iTRAQ) . Amin-reaktiv TMT finns i duplex, 6-plex och 10-plex och nu 11-plex set. Amin-reaktiv iTRAQ finns i 4-plex och 8-plex former.

^ ^a ^b ^c Bantscheff, Marcus; Lemeer, Simone; Savitski, Mikhail M.; Kuster, Bernhard (2012-09-01). "Kvantitativ masspektrometri i proteomik: uppdatering av kritisk granskning från 2007 till idag". Analytisk och bioanalytisk kemi . 404 (4): 939–965. doi : 10.1007/s00216-012-6203-4 . ISSN 1618-2650 . PMID 22772140 . S2CID 21085313 .
^ ^a ^b ^c Yates, John (2014). "Isobarisk märkningsbaserad relativ kvantifiering i hagelgevärsproteomik" . Journal of Proteome Research . 13 (12): 5293–5309. doi : 10.1021/pr500880b . PMC 4261935 . PMID 25337643 .
^ Thompson, Andrew; Schäfer, Jürgen; Kuhn, Karsten; Kienle, Stefan; Schwarz, Josef; Schmidt, Günter; Neumann, Thomas; Hamon, Christian (2003). "Tandemmasstaggar: En ny kvantifieringsstrategi för jämförande analys av komplexa proteinblandningar av MS/MS" . Analytisk kemi . 75 (8): 1895–1904. doi : 10.1021/ac0262560 . ISSN 0003-2700 . PMID 12713048 . S2CID 30820837 .
^ ^a ^b Lee, Kelvin H.; Choe, Leila H.; Aggarwal, Kunal (2006-06-01). "Hagelgevärsproteomik med iTRAQ isobariska taggar" . Briefingar i funktionell genomik . 5 (2): 112–120. doi : 10.1093/bfgp/ell018 . ISSN 2041-2649 . PMID 16772272 .
^ Dayon L, Hainard A, Licker V, Turck N, Kuhn K, Hochstrasser DF, Burkhard PR, Sanchez JC (2008). "Relativ kvantifiering av proteiner i mänskliga cerebrospinalvätskor av MS/MS med användning av 6-plex isobariska taggar" . Anal. Chem . 80 (8): 2921–31. doi : 10.1021/ac702422x . PMID 18312001 . S2CID 12362045 .
^ Choe L, D'Ascenzo M, Relkin NR, Pappin D, Ross P, Williamson B, Guertin S, Pribil P, Lee KH (2007). "8-plex kvantifiering av förändringar i cerebrospinalvätskans proteinuttryck hos patienter som genomgår intravenös immunglobulinbehandling för Alzheimers sjukdom" . Proteomik . 7 (20): 3651–60. doi : 10.1002/pmic.200700316 . PMC 3594777 . PMID 17880003 .

[:1-1] Bantscheff, Marcus; Lemeer, Simone; Savitski, Mikhail M.; Kuster, Bernhard (2012-09-01). "Kvantitativ masspektrometri i proteomik: uppdatering av kritisk granskning från 2007 till idag". Analytisk och bioanalytisk kemi . 404 (4): 939–965. doi : 10.1007/s00216-012-6203-4 . ISSN 1618-2650 . PMID 22772140 . S2CID 21085313 .

[:02-2] Yates, John (2014). "Isobarisk märkningsbaserad relativ kvantifiering i hagelgevärsproteomik" . Journal of Proteome Research . 13 (12): 5293–5309. doi : 10.1021/pr500880b . PMC 4261935 . PMID 25337643 .

[3] Thompson, Andrew; Schäfer, Jürgen; Kuhn, Karsten; Kienle, Stefan; Schwarz, Josef; Schmidt, Günter; Neumann, Thomas; Hamon, Christian (2003). "Tandemmasstaggar: En ny kvantifieringsstrategi för jämförande analys av komplexa proteinblandningar av MS/MS" . Analytisk kemi . 75 (8): 1895–1904. doi : 10.1021/ac0262560 . ISSN 0003-2700 . PMID 12713048 . S2CID 30820837 .

[:2-4] Lee, Kelvin H.; Choe, Leila H.; Aggarwal, Kunal (2006-06-01). "Hagelgevärsproteomik med iTRAQ isobariska taggar" . Briefingar i funktionell genomik . 5 (2): 112–120. doi : 10.1093/bfgp/ell018 . ISSN 2041-2649 . PMID 16772272 .

[pmid183120012-5] Dayon L, Hainard A, Licker V, Turck N, Kuhn K, Hochstrasser DF, Burkhard PR, Sanchez JC (2008). "Relativ kvantifiering av proteiner i mänskliga cerebrospinalvätskor av MS/MS med användning av 6-plex isobariska taggar" . Anal. Chem . 80 (8): 2921–31. doi : 10.1021/ac702422x . PMID 18312001 . S2CID 12362045 .

[pmid178800032-6] Choe L, D'Ascenzo M, Relkin NR, Pappin D, Ross P, Williamson B, Guertin S, Pribil P, Lee KH (2007). "8-plex kvantifiering av förändringar i cerebrospinalvätskans proteinuttryck hos patienter som genomgår intravenös immunglobulinbehandling för Alzheimers sjukdom" . Proteomik . 7 (20): 3651–60. doi : 10.1002/pmic.200700316 . PMC 3594777 . PMID 17880003 .