I-CreI

DNA-endonukleas I-Crel-
identifierare
Organism	Chlamydomonas reinhardtii
Symbol	?
UniProt	P05725
Söka efter Strukturer Schweizisk modell Domäner InterPro

I- Cre I är ett målsökande endonukleas vars gen först upptäcktes i kloroplastgenomet hos Chlamydomonas reinhardtii , en art av encelliga grönalger . Den är uppkallad efter de fakta som: den finns i en I ntron; den isolerades från C lamydomonas re inhardtii ; det var den första ( I ) sådan gen som isolerades från C. reinhardtii . Dess gen finns i en grupp I- intron i den ribosomala RNA -genen 23S från C. reinhardtii -kloroplasten, och I- Cre I uttrycks endast när dess mRNA splitsas från det primära transkriptet av 23S-genen. I- Crel - enzym , som fungerar som en homodimer , känner igen en 22-nukleotidsekvens av duplex-DNA och klyver en fosfodiesterbindning på varje sträng i specifika positioner. I- Cre I är en medlem av LAGLIDADG-familjen av homing-endonukleaser, som alla har ett konserverat LAGLIDADG-aminosyramotiv som bidrar till deras associativa domäner och aktiva platser. När det I- Cre I-innehållande intronet möter en 23S-allel som saknar intronet, " hemmar" I- CrI -enzymet "intron-minus"-allelen av 23S och påverkar dess moderintrons infogning i intron-minus-allelen. Introner med detta beteende kallas mobila introner. Eftersom I- Cre I sörjer för sin egen förökning samtidigt som den inte ger värden någon nytta, är det ett exempel på själviskt DNA .

Upptäckt

I- Cre I observerades först som en mellanliggande sekvens i 23S rRNA- genen av C. reinhardtii kloroplastgenomet. 23S-genen är en RNA-gen , vilket betyder att dess transkript inte översätts till protein. Som RNA utgör det en del av den stora subenheten av ribosomen . En öppen läsram som kodar för ett protein på 163 aminosyror hittades i denna 23S-intron, vilket tyder på att ett protein kan underlätta det mobila intronets målsökande beteende. Dessutom hade det förutsagda proteinet ett LAGLIDADG-motiv, en konserverad aminosyrasekvens som finns i andra proteiner som kodas för i grupp I mobila introner. En studie från 1991 fastställde att ORF kodar för ett DNA-endonukleas, I- Cre I, som selektivt skär ett ställe som motsvarar där intronet skarvas ut ur det primära 23S-transkriptet. Studien visade också att intronet kunde invadera 23S-alleler som inte redan hade det.

Utbredningsmekanism

I- Cre I har utvecklats för att skära en 22-nukleotidsekvens av DNA som förekommer i alleler av 23S ribosomala RNA-genen som saknar det I- Cre I-innehållande intronet. När en sådan "intron-minus" allel skärs, aktiveras vägar för dubbelsträngsbrottsreparation i cellen. Cellen använder som mall för att reparera 23S-allelen som gav det ansvariga I- Cre I-enzymet, och replikerar på så sätt det I- Cre I-innehållande intronet. Den resulterande "intron-plus"-allelen innehåller inte längre ett intakt målställe för I- Crel -enzymet och klyvs därför inte. Eftersom denna intron tillhandahåller sin egen replikation utan att ge någon fördel för sin värd, är I- Cre I en form av själviskt DNA .

Strukturstudier och möjliga tillämpningar

Röntgenkristallstrukturen hos I- Cre I bunden till sin ursprungliga målsökningsplats.

Eftersom I- Cre I har utvecklats för att skära en så lång sekvens av DNA, till skillnad från restriktionsendonukleaser som vanligtvis skär fyra- eller sex-nukleotidsekvenser, kan den skära ett enda ställe i ett mycket stort genom . En sekvens med fyra eller sex nukleotider förväntas förekomma många, många gånger i ett genom med miljoner eller miljarder nukleotider helt enkelt av en slump, medan en 22-nukleotidsekvens bara kan förekomma en gång (10 9 / ⁴ 6 ^vs. 10 ⁹ / 4 ²² ). Denna specificitet av I- Cr I-klyvning gör I- Cr I till ett lovande verktyg för geninriktning . Om en person skulle ha en sjukdom på grund av en defekt allel av någon gen , skulle det vara bra att kunna ersätta den allelen med en funktionell. Om man kunde få I- Cre I att skära DNA:t endast i den defekta allelen samtidigt som man ger en normal allel för cellen att använda som en reparationsmall, skulle patientens eget homologa rekombinationsmaskineri kunna infoga den önskade allelen i stället för den dysfunktionella. . Specificiteten hos I- Crel tillåter också minskningen av skadliga effekter på grund av dubbelsträngsbrott utanför genen av intresse.

För att kunna använda I- Cre I som ett verktyg på detta sätt är det nödvändigt att få det att känna igen och klyva sekvenser av DNA som skiljer sig från dess ursprungliga målsökningsställe. Ett från Escherichia coli för att studera sambandet mellan I- Cre I-strukturen och dess referensplatsspecificitet skapades 1997. 1997 bestämdes strukturen för I-CreI-proteinet och 1998 band dess kristallstruktur till dess ursprungliga DNA-hemsökningsställe löstes, vilket i hög grad hjälpte forskningen för att ändra identifieringsplatsen för proteinet. Mutanta former av proteinet har sedan dess skapats som uppvisar förändrad referensställesspecificitet. Ett genetiskt system i Saccharomyces cerevisiae har också skapats, vilket ger ytterligare I- Cre I-mutanter med modifierade referensställesspecificiteter.

I- Cre I har redan använts framgångsrikt för att inducera homolog rekombination i Drosophila melanogaster , en extremt populär eukaryotisk modellorganism . Det verkar mycket troligt att framsteg inom molekylärbiologiska tekniker och generering av ett bibliotek av I- Cre I-härledda nya endonukleaser så småningom kommer att möjliggöra inriktning av många gener av etiologisk betydelse.