Fluorometer

Fluorometer designad för att mäta klorofyllfluorescens i växter

En fluorometer , fluorimeter eller fluormeter är en enhet som används för att mäta parametrar för synligt spektrum av fluorescens : dess intensitet och våglängdsfördelning av emissionsspektrum efter excitation av ett visst ljusspektrum. Dessa parametrar används för att identifiera närvaron och mängden av specifika molekyler i ett medium. Moderna fluorometrar kan detektera fluorescerande molekylkoncentrationer så låga som 1 del per biljon.

Fluorescensanalys kan vara storleksordningar känsligare än andra tekniker. Tillämpningar inkluderar kemi / biokemi , medicin , miljöövervakning . Till exempel används de för att mäta klorofyllfluorescens för att undersöka växtfysiologi .

Komponenter och design

En förenklad design av komponenterna i en fluorometer

Typiskt använder fluorometrar en dubbelstråle. Dessa två strålar arbetar i tandem för att minska bruset som skapas från strålningseffektfluktuationer. Den övre strålen passerar genom ett filter eller monokromator och passerar genom provet. Den nedre strålen leds genom en dämpare och justeras för att försöka matcha den fluorescerande effekten som avges från provet. Ljus från provets fluorescens och den nedre, dämpade strålen detekteras av separata givare och omvandlas till en elektrisk signal som tolkas av ett datorsystem.

Inuti maskinen är givaren som detekterar fluorescens skapad från den övre strålen placerad ett avstånd från provet och i en 90-graders vinkel från den infallande övre strålen. Maskinen är konstruerad så här för att minska ströljuset från den övre strålen som kan träffa detektorn. Den optimala vinkeln är 90 grader. Det finns två olika sätt att hantera valet av infallande ljus som ger vika för olika typer av fluorometrar. Om filter används för att välja ljusvåglängder kallas maskinen en fluorometer. Medan en spektrofluorometer vanligtvis använder två monokromatorer, kan vissa spektrofluorometrar använda ett filter och en monokromator. Där bredbandsfiltret i detta fall verkar för att reducera ströljus, inklusive från oönskade diffraktionsordningar för diffraktionsgittret i monokromatorn.

Ljuskällor för fluorometrar är ofta beroende av vilken typ av prov som testas. Bland de vanligaste ljuskällorna för fluorometrar är lågtryckskvicksilverlampan . Detta ger många excitationsvåglängder, vilket gör den till den mest mångsidiga. Denna lampa är dock inte en kontinuerlig strålningskälla. Xenonbågslampan används när en kontinuerlig strålningskälla behövs . Båda dessa källor ger ett lämpligt spektrum av ultraviolett ljus som inducerar kemiluminescens . Dessa är bara två av de många möjliga ljuskällorna. ^{[ citat behövs ]}

Glas- och kiselkyvetter är ofta de kärl som provet placeras i. Se till att inte lämna fingeravtryck eller andra märken på utsidan av kyvetten, eftersom detta kan ge oönskad fluorescens. "Spectro grade" lösningsmedel såsom metanol används ibland för att rengöra kärlets ytor för att minimera dessa problem.

Används

Mejeriindustrin

Fluorimetri används i stor utsträckning av mejeriindustrin för att verifiera om pastörisering har varit framgångsrik. Detta görs med hjälp av ett reagens som hydrolyseras till en fluorofor och fosforsyra av alkaliskt fosfatas i mjölk. Om pastöriseringen har lyckats kommer alkaliskt fosfatas att denatureras helt och provet kommer inte att fluorescera. Detta fungerar eftersom patogener i mjölk dödas av någon värmebehandling som denaturerar alkaliskt fosfatas.

Fluorescensanalyser krävs av mjölkproducenter i Storbritannien för att bevisa att framgångsrik pastörisering har skett, så alla brittiska mejerier innehåller fluorimetriutrustning.

Proteinaggregation och TSE-detektion

Tioflaviner är färgämnen som används för histologisk färgning och biofysikaliska studier av proteinaggregation. Till exempel används tioflavin T i RT-QuIC- tekniken för att detektera transmissibel spongiform encefalopati som orsakar felveckade prioner .

Oceanografi

Fotosyntetisk växtplankton från Stilla havet observerad med hjälp av epifluorescensmikroskopi (blått spännande ljus).

Filtrera efter att ett vattenprov har filtrerats genom det för att isolera växtplanktonet på filtret före klorofyllfluorometri på bänk.

Fluorometrar används ofta inom oceanografi för att mäta klorofyllkoncentrationer baserat på klorofyllfluorescens av växtplanktoncellpigment . Klorofyllfluorescens är en allmänt använd proxy för mängden (biomassa) av mikroskopiska alger i vattnet. I labbet efter vattenprovtagning extraherar forskare pigmenten ur ett filter som har växtplanktonceller på sig, och mäter sedan fluorescensen av extraktet i en bänkfluorometer i ett mörkt rum. För att direkt mäta klorofyllfluorescens "in situ" (i vattnet) använder forskare instrument utformade för att mäta fluorescens optiskt (till exempel sonder med extra elektroniska optiska sensorer anslutna). De optiska sensorerna avger blått ljus för att excitera växtplanktonpigment och få dem att fluorescera eller avge rött ljus. Sensorn mäter denna inducerade fluorescens genom att mäta det röda ljuset som en spänning, och instrumentet sparar det i en datafil. Spänningssignalen från sensorn omvandlas till en koncentration med en kalibreringskurva i labbet, med antingen rödfärgade färgämnen som Rhodamine , standarder som Fluorescein eller levande växtplanktonkulturer.

Havsklorofyllfluorescens mäts på forskningsfartyg, småbåtar, bojar, bryggor och bryggor över hela världen. Fluorometrimätningar används för att kartlägga klorofyllkoncentrationer till stöd för fjärranalys av havsfärger . Speciella fluorometrar för havsvatten kan mäta egenskaper utöver den totala mängden fluorescens, såsom fotokemins kvantutbyte , tidpunkten för fluorescensen och fluorescensen hos celler när de utsätts för ökande mängder ljus. Vattenbruksverksamheter som fiskodlingar använder fluorometrar för att mäta tillgången på mat för att filtermata djur som musslor och för att upptäcka uppkomsten av skadliga algblomningar (HAB) och/eller " röda tidvatten " (inte nödvändigtvis samma sak).

Molekylärbiologi

Fluorometrar kan användas för att bestämma nukleinsyrakoncentrationen i ett prov.

Fluorometer typer

Det finns två grundläggande typer av fluorometrar: filterfluorometrar och spektrofluorometrar. Skillnaden mellan dem är hur de väljer våglängderna för infallande ljus; filterfluorometrar använder filter medan spektrofluorometrar använder gallermonokromatorer. Filterfluorometrar köps eller byggs ofta till en lägre kostnad men är mindre känsliga och har mindre upplösning än spektrofluorometrar. Filterfluorometrar kan också fungera endast vid våglängderna för de tillgängliga filtren, medan monokromatorer i allmänhet är fritt avstämbara över ett relativt brett område. Den potentiella nackdelen med monokromatorer härrör från samma egenskap, eftersom monokromatorn är kapabel till felkalibrering eller feljustering, där filtrens våglängd är fixerad när den tillverkas.

Se även

Fluorescensspektroskopi , för en mer utförlig diskussion om instrumentering
Klorofyllfluorescens , för att undersöka växtekofysiologi.
Integrerad fluorometer för att mäta gasutbyte och klorofyllfluorescens hos löv.
Radiometer , för att mäta olika elektromagnetisk strålning
Spektrometer , för att analysera spektrum av elektromagnetisk strålning
Scatterometer , för att mäta spridd strålning
Mikrofluorimetri , för att mäta fluorescens på mikroskopisk nivå
Interferensfilter , tunnfilmsfilter som fungerar genom optisk interferens, som visar hur de kan ställas in i vissa fall