Fluorescenspolarisationsimmunanalys

Fluorescenspolarisation/anisotropi Tredimensionellt diagram av teorin

Fluorescenspolarisationsimmunanalys ( FPIA ) är en klass av biokemiska tester in vitro som används för snabb detektering av antikroppar eller antigen i provet. FPIA är en konkurrenskraftig homogen analys , som består av en enkel förberedelse- och avläsningsmetod, utan krav på separations- eller tvättsteg.

Basen för analysen är fluorescensanisotropi , även känd som fluorescenspolarisation. Om en fluorescerande molekyl är stationär och exponeras för planpolariserat ljus , kommer den att bli exciterad och följaktligen avge strålning tillbaka till det polariserade planet. Men om den exciterade fluorescerande molekylen är i rörelse (roterande eller translationell) under den fluorescerande livstiden, kommer den att avge ljus i en annan riktning än excitationsplanet. Den fluorescerande livslängden är tiden mellan absorptionsmomentet och det fluorescerande emissionsmomentet.

Vanligtvis är hastigheten med vilken en molekyl roterar en indikation på dess storlek. När en fluorescensmärkt molekyl (spårämne) binder till en annan molekyl kommer rotationsrörelsen att förändras, vilket resulterar i en förändrad intensitet av planpolariserat ljus, vilket resulterar i förändrad fluorescenspolarisation. Fluorescenspolarisationsimmunanalyser använder ett fluoroforbundet antigen som när det binds till antikroppen av intresse kommer att öka fluorescenspolarisation . Förändringen i polarisation är proportionell mot mängden antigen i provet och mäts med en fluorescenspolarisationsanalysator.

Historia

Fluorescenspolarisering observerades första gången av F. Weigert 1920. Han experimenterade med lösningar av fluorescein, eosin och andra färgämnen vid olika temperaturer och viskositeter. När han observerade att polarisering ökade med viskositeten hos lösningsmedlet och storleken på färgämnesmolekylen, men minskade med en ökning av temperaturen, drog han slutsatsen att polariseringen ökade med en minskning av rörligheten hos de emitterande arterna. Från 1925 till 1926 Francis Perrin en kvantitativ teori för fluorescenspolarisering i flera betydande publikationer som fortfarande är relevanta än i dag.

Sedan Perrins bidrag har tekniken vuxit från att bestämma bindningsisotermer under starkt kontrollerade parametrar, till studiet av antigen - antikropp , småmolekyler - protein och hormon - receptorbindande interaktioner. En fluorescenspolarisationsimmunanalys beskrevs och användes först på 1960-talet. Den kompetitiva homogena egenskapen gjorde det möjligt för fluorescenspolarisationsimmunoanalysen att automatiseras mycket lättare än andra immunanalystekniker såsom radioimmunoanalyser eller enzymkopplade immunanalyser .

Trots att tekniken har sitt ursprung som en metod för direkta interaktionsstudier, har tekniken använts genom high-throughput screening (HTS) sedan mitten av 1990-talet för att underlätta läkemedelsupptäcktsprocessen genom att studera komplex enzymatisk interaktion .

Konkurrenskraftig homogen immunanalys

Princip

FPIA kvantifierar förändringen i fluorescenspolarisering av reaktionsblandningar av fluorescensmärkt spårämne, provantigen och definierad antikropp . Att arbeta under fast temperatur och viskositet tillåter fluorescenspolarisationen att vara direkt proportionell mot storleken på fluoroforen. Fritt spårämne i lösning har en lägre fluorescenspolarisation än antikroppsbundet spårämne med långsammare Brownsk rörelse . Spårämnet och det specifika antigenet kommer att tävla om att binda till antikroppen och om antigenet har låg koncentration kommer mer spårämne att bindas till antikroppen vilket resulterar i en högre fluorescenspolarisering och vice versa.

En konventionell FPIA följer proceduren nedan:

En specifik mängd prov tillsätts till reaktionsbuffert.
Lösningen får komma i jämvikt vid rumstemperatur under cirka två minuter.
Lösningen utvärderas i en fluorescenspolarisationsanalysator för att samla in en baslinjemätning.
En specifik mängd antigen konjugerat med fluorofor tillsätts till lösningen.
Lösningen bringas i jämvikt igen under cirka två minuter.
Lösningen utvärderas igen av fluorescenspolarisationsanalysatorn.
Fluorescenspolarisationsvärdet för den spårämne innehållande lösningen jämförs med baslinjen och skillnadens storlek är proportionell mot kvantiteten målanalyt i provet.

Ansökningar

FPIA har dykt upp som en användbar teknik för kvantifiering av små molekyler i blandningar, inklusive: bekämpningsmedel , mykotoxiner i livsmedel , farmaceutiska föreningar i avloppsvatten, metaboliter i urin och serum som tyder på droganvändning ( cannabinoider , amfetaminer , barbiturater , methadiazepiner , opiater och PCP ) och olika småmolekylära toxiner . Liksom med analys av hormon - receptor -interaktioner.

Se även