Fläck 42 RNA
| Spot 42 RNA | |
|---|---|
 Förutspådd sekundär struktur och sekvenskonservering av Spot_42
| |
| Identifiers | |
| Symbol | Spot_42 |
| Alt. Symboler | Plats 42 |
| Rfam | RF00021 |
| Övriga uppgifter | |
| RNA -typ | Gen ; sRNA |
| Domän(er) | Bakterie |
| SÅ | SO:0000389 |
| PDB- strukturer | PDBe |
Spot 42 ( spf ) RNA är ett regulatoriskt icke-kodande bakteriellt litet RNA som kodas av spf (spot forty-two) genen . Spf finns i gammaproteobakterier och majoriteten av experimentellt arbete på Spot42 har utförts i Escherichia coli och nyligen i Aliivibrio salmonicida . I cellen spelar Spot42 viktiga roller som en regulator i kolhydratmetabolism och upptag, och dess uttryck aktiveras av glukos och hämmas av cAMP - CRP -komplexet.
sRNA:t transkriberas från en separat promotor och binder till budbärar-RNA- mål genom ofullkomlig basparning. Halveringstiden för Spot42 in vivo är 12 till 13 minuter vid 37 °C . När den odlas i media kompletterat med glukos innehåller varje cell 100–200 Spot42-kopior. [ Citat behövs ] Motsvarande nivå reduceras dock 3–4 gånger när celler odlas i succinat eller när cAMP tillsätts till celler odlade i glukos.
Upptäckt
Spot42 beskrevs först 1973 som en instabil RNA- art på 109 nukleotider i Escherichia coli . Det upptäcktes genom polyakrylamidgelelektrofores och 2D-fingeravtryck i ett försök att studera ackumuleringen av små RNA i E. coli under aminosyrasvält . I dessa experiment var den elektroforetiska rörligheten för Spot42 liknande den för 5S rRNA . 1979 visade sig Spot42 ackumuleras under tillväxt i närvaro av glukos (dvs när adenosin 3',5'-cykliskt monofosfat (cAMP) är lågt). Under tillväxt med en kolkälla som inte är glukos (dvs när cAMP-koncentrationerna är höga) visade sig Spot42-koncentrationerna vara signifikant lägre.
Senare experiment visade att överuttryck av Spot42 (~10-faldig ökning) resulterade i försämrad tillväxt och minskad förmåga att anpassa sig till skiftningar till rikare media. Vidare resulterade en övergång från glukos till succinat som kolkälla i en lång fördröjningsperiod och långsam tillväxthastighet. Det angavs också att orsaken till de onormala svaren orsakades av ett förhöjt antal överdrivna Spot42 RNA-genprodukter snarare än överskott av genen i sig. En deletionsstudie av spf i E. coli- celler resulterade i livskraftiga spf-nullmutanter, vilket indikerar att Spot42 är icke-essentiellt, åtminstone under kontrollerade labbförhållanden.
Genomisk lokalisering och naturlig fördelning
Den naturliga fördelningen av spf -genen är begränsad till 5 ordningar av gammaproteobakterier; Enterobacteriales, Aeromonadales, Vibrionales, Alteromonadales, Chromatiales.
Enterobacteriaceae
spf - genen är mycket konserverad i släkten Escherichia , Shigella , Klebsiella , Salmonella , Yersinia inom familjen Enterobacteriaceae . I E. coli flankeras spf-genen av polA ( uppströms ) och yihA (nedströms). En CRP- bindande sekvens och -10 och -35 promotorsekvenser finns uppströms om spf .
Vibrionaceae
Spf är också mycket konserverad inom familjen Vibrionaceae och identifierades nyligen i alla 76 tillgängliga Vibrionaceae- genom (t.ex. Vibrio , Aliivibrio , Photobacterium och Grimontia genera ). I t.ex. Vibrio cholerae , Vibrio vulnificus , Aliivibrio fischeri och Aliivibrio salmonicida flankeras spf-genen av polA ( uppströms ) och en sRNA- gen som kodar för det nya VSsRNA24 (nedströms).
Biologisk funktion och specifika mål
Det var under några år oklart om funktionen av punkt 42 förmedlades genom själva 109 nukleotid -RNA :t eller om funktionen förmedlades genom den 14 aminosyror långa peptiden som hypotetiskt kodas inifrån sRNA-sekvensen. Detta baserades på observationen att Spot42 innehåller strukturella egenskaper som liknar andra icke-kodande RNA som finns i E. coli (som 6S RNA och lambda bakteriofag), såväl som egenskaper som vanligtvis finns i mRNA (dvs polypurinsekvens följt av AUG, 14 aminosyror och en UGA-terminator). Användning av en filterbindningsanalys och andra metoder visade att Spot 42 inte är ett mRNA. I detta tillvägagångssätt testades affiniteten mellan Spot42 och 70S-ribosomen . Här visade fläck 42 mycket ineffektiv bindning till renade 70S-ribosomer, vilket ledde till slutsatsen att funktionen av fläck 42 medieras av själva RNA:t. Bækkedal och Haugen gjorde en Spot42 konsensus sekundär struktur baserad på alla kända "spf" sekvenser vid den tiden (2015) och fann att genen spot42 är mycket konserverad över de 5 ordningarna den identifieras. Den sekundära strukturen har mycket konserverade nukleotidpositioner som har potential att delta i bindning med kända mRNA-mål.
Biologisk funktion av Spot42 i Escherichia coli
I E. coli ackumuleras fläck 42 under tillväxt i närvaro av glukos (dvs när adenosin 3',5'-cykliskt monofosfat ( cAMP ) är lågt). Den direkta känsligheten hos Spot 42-nivåer för glukos och cAMP beror på undertryckande av spf -uttryck av ett cAMP-CRP (cAMP-receptorprotein)-komplex. Spot42 finns i 100–200 exemplar per cell när celler odlas i glukos, och reduceras 3–4 gånger när celler odlas i succinat (en sekundär kolkälla). Reduktionen av Spot42 i celler odlade i sekundära kolkällor är ett resultat av bindning av cAMP-CRP-komplexet till spf-promotom, vilket negativt reglerar transkriptionen av Spot42. Senare ledde närheten till spf till polA (gen som kodar för DNA-polymeras I ) till att Polayes och medarbetare testade om produkterna från dessa gener kunde påverka varandra. De fann att genom att minska nivåerna av Spot 42, antingen genom deletion av spf eller genom att manipulera tillväxtförhållandena, reducerades DNA pol A-aktiviteten. Den underliggande mekanismen för denna observation är dock fortfarande okänd.
Spot42-mål i Escherichia coli
Spot42 kan interagera direkt med mRNA-mål genom basparning. Det första Spot 42-målet upptäcktes av Møller et al. som visade att fläck 42 specifikt binder till en kort komplementär region vid translationsinitieringsregionen för galK (kodar ett galaktoinas). galK är den tredje genen i galaktosoperonet , som innehåller fyra gener ( galETKM ) och producerar ett polycistroniskt mRNA. Fläck 42 förmedlar disordinat uttryck av gal-operonet (dvs. de individuella generna i operonet uttrycks inte på liknande sätt) genom att binda till galK Shine-Dalgarno -regionen och därigenom blockera ribosombindning och translation av galK -genen. Den fysiologiska betydelsen av koordinatuttrycket är oklar, men antyder att Spot 42 spelar en roll vid finjustering av genuttryck för att optimera utnyttjandet av kolkällor.
Beisel och Storz visade med mikroarrayanalys och reporterfusioner att Spot 42 spelar en bredare roll i metabolismen genom att reglera minst 14 operoner. Dessa operoner innehåller ett antal gener involverade i upptag och katabolism av icke-gynnade kolkällor. Under överuttryck av punkt 42 uppvisar sexton olika gener 2 gånger förhöjda nivåer av mRNA. De identifierade generna är mestadels involverade i central och sekundär metabolism, såväl som upptag och katabolism av icke-föredragna kolkällor och oxidation av NADH.
En jämförande genomik tillvägagångssätt kunde bredda kopplingen mellan Spot 42 med Escherichia coli TCA-cykeln. Utöver det tidigare rapporterade, förutspåddes TCA-anslutna mål gltA både icd och sucC beräkningsmässigt och verifierades därefter experimentellt som direkta mål för Spot 42. Dessutom upptäckte detta tillvägagångssätt gdhA som direkt mål för Spot42. gdhA kodar för glutamatdehydrogenaset och kopplar samman citratcykeln och kvävemetabolism.
Biologisk funktion och mål för Spot42 RNA i Salmonella
En studie som kombinerar en transkriptom bred bindningskarta av Hfq -proteinet med en jämförande målförutsägelse har hjälpt till att identifiera mglB (STM2190) mRNA som ett direkt mål för Spot42.
Biologisk funktion och mål för Spot42 RNA i A. salmonicida
Observationen att A. salmonicida innehåller spf- genen (som kodar för fläck 42), men saknar galK- operonet (det naturliga målet för fläck 42 i E. coli ), har inspirerat forskare att studera rollen av fläck 42 i denna fiskpatogen . A. salmonicida kan inte använda galaktos (saknar gal operon) i minimalt medium och tillsats av galaktos har liten effekt på tillväxthastigheten. När celler odlas i glukos ökar nivån av Spot42 16–40 gånger, men minskas däremot 3 gånger när cAMP tillsätts, vilket indikerar att Spot42 förmodligen har liknande roller som i E. coli (dvs i kolhydratmetabolism ) . Det har antagits att Spot 42 fungerar tillsammans med en ny sRNA-gen, kallad VSsrna24 , belägen 262 nt nedströms spf . VSsrna42 - RNA:t är ungefär 60 nt långt och har ett uttrycksmönster som är motsatt det för Spot42. Vidare, i en spf- deletionsmutant uppreglerades en gen som kodar för ett pirinliknande protein 16 gånger. Pirin har nyckelroller i den centrala metabolismen genom att reglera aktiviteten av pyruvatdehydrogenas E1 och väljer därför om pyruvat ska fermenteras eller genomgå andning genom TCA-cykeln och elektrontransport .