Dragkraftsmikroskopi

Dragkraftsmikroskopi (TFM) är en experimentell metod för att bestämma dragkrafterna på ytan av en biologisk cell genom att erhålla mätningar av det omgivande förskjutningsfältet inom en extracellulär matris in vitro (ECM) .

Översikt

Det dynamiska mekaniska beteendet hos cell-ECM och cell-cell-interaktioner är känt för att påverka ett stort antal cellulära funktioner, inklusive nekros, differentiering , vidhäftning , migration , rörelse och tillväxt . TFM använder experimentellt observerade ECM-förskjutningar för att beräkna dragkraften , eller spänningsvektorn, vid ytan av en cell. Innan TFM observerade ansträngningar cellulära dragningar på silikongummisubstrat som skrynklas runt celler; exakt kvantifiering av dragningarna i en sådan teknik är emellertid svår på grund av rynkningens olinjära och oförutsägbara beteende. Flera år senare introducerades terminologin TFM för att beskriva en mer avancerad beräkningsprocedur som skapades för att omvandla mätningar av substratdeformation till uppskattade dragspänningar.

Allmän metodik

I konventionell TFM sås cellkulturer på eller i en optiskt transparent 3D ECM inbäddad med fluorescerande mikrosfärer (vanligtvis latexpärlor med diametrar från 0,2-1 μm ). Ett brett utbud av naturliga och syntetiska hydrogeler kan användas för detta ändamål, med förutsättningen att materialets mekaniska uppträdande är välkaraktäriserat, och hydrogelen är kapabel att upprätthålla cellulär viabilitet. Cellerna kommer att utöva sina egna krafter i detta substrat som följaktligen kommer att förskjuta pärlorna i den omgivande ECM. I vissa studier används ett rengöringsmedel , enzym eller läkemedel för att störa cytoskelettet och därigenom förändra, eller ibland helt eliminera, de drag som cellen genererar.

Först beräknas ett kontinuerligt förskjutningsfält från ett par bilder: den första bilden är referenskonfigurationen av mikrosfärer som omger en isolerad cell, och den andra bilden är samma isolerade cell omgiven av mikrosfärer som nu är förskjutna på grund av den cellulärt genererade dragkrafter. Konfokal fluorescensmikroskopi används vanligtvis för att avbilda cellytan och fluorescerande pärlor. Efter beräkning av translationsförskjutningsfältet mellan en deformerad och odeformerad konfiguration kan ett töjningsfält beräknas. Från töjningsfältet kan spänningsfältet som omger cellen beräknas med kunskap om spännings-töjningsbeteendet, eller konstitutiv modell, för det omgivande hydrogelmaterialet. Det är möjligt att gå ett steg längre och använda stressfältet för att beräkna dragkrafterna vid cellens yta, om de normala vektorerna till cellytan kan erhållas från en 3D- bildstapel . Även om denna procedur är ett vanligt sätt att erhålla de cellulära dragkrafterna från mikrosfärförskjutning, har vissa studier framgångsrikt använt en omvänd beräkningsalgoritm för att ge dragfältet.

Begränsningar

Den rumsliga upplösningen av dragfältet som kan återvinnas med TFM begränsas av antalet förskjutningsmätningar per område. Avståndet mellan oberoende förskjutningsmätningar varierar med experimentella uppställningar, men är vanligtvis i storleksordningen en mikrometer. De dragmönster som produceras av celler innehåller ofta lokala maxima och minima som är mindre. Detektering av dessa fina variationer i lokal cellulär dragkraft med TFM är fortfarande utmanande.

Framsteg

I 2D TFM odlas celler som ett monolager på ytan av ett tunt substrat med en avstämbar styvhet, och mikrosfärerna nära ytan av substratet genomgår deformation genom cell-ECM-anslutningar. 2.5D-cellkulturer odlas på liknande sätt ovanpå ett tunt lager av ECM, och utspädda strukturella ECM-proteiner blandas till mediet som tillsätts ovanför cellerna och substratet. Även om det mesta av det avgörande arbetet i TFM utfördes i 2D eller 2.5D, kräver många celltyper de komplexa biofysikaliska och biokemiska signalerna från en 3D ECM för att bete sig på ett verkligt fysiologiskt realistiskt sätt i en in vitro- miljö .

När rotationen eller sträckningen av en delvolym är stor, kan fel införas i beräkningen av cellytdragningar eftersom de flesta TFM-tekniker använder ett beräkningsramverk baserat på linjär elasticitet. De senaste framstegen inom TFM har visat att celler kan utöva deformationer med töjningsstorlekar upp till 40%, vilket kräver användning av en finit deformationsteori för att ta hänsyn till stora töjningsstorlekar.

Ansökningar

Även om TFM ofta används för att observera dragningar vid ytan av en rumsligt isolerad individuell cell, kan en variation av TFM också användas för att analysera det kollektiva beteendet hos flercelliga system. Till exempel observeras cellulära migrationshastigheter och plitotaxi vid sidan av en beräknad spänningsvariationskarta av ett monolagerskikt av celler, i ett tillvägagångssätt som kallas monolagerspänningsmikroskopi. Det mekaniska beteendet hos enstaka celler kontra ett sammanflytande skikt av celler skiljer sig åt genom att monoskiktet upplever ett "dragkamp"-tillstånd. Det finns också bevis på en omfördelning av dragningar som kan ske tidigare än förändringar i cellpolaritet och migration.

TFM har visat sig särskilt användbart för att studera durotaxis också.

TFM har nyligen använts för att utforska mekaniken för cancercellsinvasion med hypotesen att celler som genererar stora dragningar är mer invasiva än celler med lägre dragkrafter. Man hoppas också att de senaste fynden från TFM kommer att bidra till utformningen av optimala byggnadsställningar för vävnadsteknik och regenerering av det perifera nervsystemet, artärtransplantat och epitelhudceller.