Cytometri
Cytometri är mätningen av antal och egenskaper hos celler . Variabler som kan mätas med cytometriska metoder inkluderar cellstorlek , cellantal , cellmorfologi (form och struktur), cellcykelfas , DNA- innehåll och förekomsten eller frånvaron av specifika proteiner på cellytan eller i cytoplasman . Cytometri används för att karakterisera och räkna blodkroppar i vanliga blodprover som det fullständiga blodvärdet . På liknande sätt används cytometri också i cellbiologisk forskning och i medicinsk diagnostik för att karakterisera celler i ett brett spektrum av tillämpningar förknippade med sjukdomar som cancer och AIDS . [ citat behövs ]
Cytometriska enheter
Bildcytometrar
Bildcytometri är den äldsta formen av cytometri. Bildcytometrar fungerar genom att statiskt avbilda ett stort antal celler med hjälp av optisk mikroskopi . Före analys färgas celler vanligtvis för att förbättra kontrasten eller för att detektera specifika molekyler genom att märka dessa med fluorokromer . Traditionellt ses celler i en hemocytometer för att underlätta manuell räkning. [ citat behövs ]
Sedan introduktionen av digitalkameran , i mitten av 1990-talet, har automatiseringsnivån för bildcytometrar stadigt ökat. Detta har lett till kommersiell tillgänglighet av automatiserade bildcytometrar, allt från enkla cellräknare till sofistikerade screeningsystem med högt innehåll .
Flödescytometrar
På grund av de tidiga svårigheterna med att automatisera mikroskopi har flödescytometern sedan mitten av 1950-talet varit den dominerande cytometriska enheten. Flödescytometrar fungerar genom att rikta in enstaka celler med hjälp av flödestekniker. Cellerna karakteriseras optiskt eller genom användning av en elektrisk impedansmetod som kallas Coulter-principen . För att detektera specifika molekyler när de är optiskt karakteriserade, färgas celler i de flesta fall med samma typ av fluorokromer som används av bildcytometrar. Flödescytometrar ger i allmänhet mindre data än bildcytometrar, men har en betydligt högre genomströmning. [ citat behövs ]
Cellsorterare
Cellsorterare är flödescytometrar som kan sortera celler enligt deras egenskaper. Sorteringen görs genom att använda teknik som liknar den som används i bläckstråleskrivare . Vätskeströmmen bryts upp till droppar genom en mekanisk vibration. Dropparna laddas sedan elektriskt i enlighet med egenskaperna hos cellen som finns i droppen. Beroende på deras laddning avleds dropparna slutligen av ett elektriskt fält till olika behållare. [ citat behövs ]
Time-lapse cytometrar
En viktig egenskap hos time-lapse-cytometrar är deras användning av icke värmealstrande ljuskällor såsom lysdioder . Detta gör att en time-lapse-cytometer kan placeras inuti en konventionell cellkulturinkubator för att underlätta kontinuerlig observation av cellulära processer utan att värme byggs upp inuti inkubatorn.
Historia
Hemocytometer
Cytometrins tidiga historia är nära förknippad med utvecklingen av blodcellsräkning. Genom arbete av Karl von Vierordt , Louis-Charles Malassez , Karl Bürker och andra kunde blodcellskoncentrationen i slutet av 1800-talet noggrant mätas med hjälp av en blodcellsräkningskammare, hemocytometern och ett optiskt mikroskop .
Fram till 1950-talet var hemocytometern standardmetoden för att räkna blodkroppar. I tillämpningar för blodcellsräkning har hemocytometern nu ersatts av elektroniska cellräknare . Hemocytometern används dock fortfarande för att räkna celler i cellodlingslaboratorier. Successivt tas den manuella uppgiften att räkna, med hjälp av ett mikroskop, över av små automatiserade bildcytometrar. [ citat behövs ]
Fluorescensmikroskop
1904 konstruerade Moritz von Rohr och August Köhler på Carl Zeiss i Jena det första ultravioletta mikroskopet. Avsikten med mikroskopet var att få högre optisk upplösning genom att använda belysning med kortare våglängd än visuellt ljus. De upplevde dock svårigheter med autofluorescens när de observerade biologiskt material. Lyckligtvis såg Köhler potentialen med fluorescens. En filtreringsteknik för fluorescensexcitationsljus utvecklades av Heinrich Lehmann vid Zeiss 1910, baserat på arbete av Robert Wood . Men det "Lumineszenzmikroskop" han utvecklade var bara tvåa på marknaden, efter det självständigt utvecklat av Oskar Heimstädt som arbetade på C Reichert, Optische Werke AG i Wien, som idag är en del av Leica Microsystems .
Cytofotometri
I början av 1930-talet tillverkade olika företag ultravioletta fluorescerande mikroskop. Det var dags för cytometri att nu gå längre än den nu etablerade hemocytometern. Vid den här tiden Torbjörn Caspersson , verksam vid Karolinska Institutet i Stockholm, en serie av allt mer sofistikerade instrument som kallas cytofotometrar . Dessa instrument kombinerade ett fluorescerande mikroskop med en spektrofotometer för att kvantifiera cellulära nukleinsyror och deras relation till celltillväxt och funktion. Casperssons tidiga apparat verkar nu hopplöst primitiv. Men även denna primitiva apparat fick resultat och väckte uppmärksamhet från andra forskare. Många av framstegen inom analytisk cytologi från 1940-talet och framåt gjordes av människor som vallfärdade till Stockholm.
Pulscytofotometri
De första försöken att automatisera cellräkning gjordes runt andra världskriget. Gucker et al. bygger en enhet för att upptäcka bakterier i aerosoler. Lagercrantz bygger en automatiserad cellräknare baserad på mikroskopi och identifierar svårigheterna med att rikta in celler för att individuellt räknas med hjälp av mikroskopi, som Moldavan föreslog 1934. Joseph och Wallace Coulter kringgår dessa svårigheter genom att uppfinna principen att använda elektrisk impedans för att räkna och dimensionera mikroskop. partiklar suspenderade i en vätska. Denna princip är idag känd som Coulter-principen och användes i den automatiserade blodcellsräknaren som släpptes av Coulter Electronics 1954. " Coulter-räknaren " var den första kommersiella flödescytometern. [ citat behövs ]
Under 1960-talet förbättrade Dittrich, Göhde och Kamentsky den design som Caspersson banat väg för 30 år tidigare. Dittrich och Göhdes pulscytofotometer byggdes runt ett Zeiss fluorescerande mikroskop och kommersialiserades som ICP 11 av Partec GmbH 1968. Kamentskys enhet kommersialiserades av Bio/Physics Systems Inc. som Cytograph 1970. Dessa enheter kunde räkna celler, som t.ex. den tidigare Coulter-disken. Men ännu viktigare, de var också kapabla att mäta cellulära egenskaper. Dessa tidiga cytofotometrar var dock mikroskopibaserade.
Flödescytometri
1953 publicerade Crosland-Taylor ett misslyckat försök att räkna röda blodkroppar med hjälp av mikroskopi där han löste problemet med att anpassa cellerna genom att använda mantelvätska för att hydrodynamiskt fokusera cellerna. I slutet av 1960-talet byggde Van Dilla vid Los Alamos National Laboratory den första icke-mikroskopibaserade cytofotometern. Han gjorde detta genom att kombinera Crosland-Taylors genombrott med de fluorescerande färgämnena som ursprungligen utvecklades för mikroskopi och ett laserbaserat fluorescerande detektionssystem – flödescytometern som vi känner den idag. Fulwyler, även i Los Alamos, kombinerar Coulter-principen med kontinuerlig bläckstråleskrivare för att skapa den första cellsorteraren 1965.
1973 följde Steinkamp och teamet vid Los Alamos upp med en fluorescensbaserad cellsorterare.
1978, vid American Engineering Foundations konferens i Pensacola, Florida, ändrades namnet pulscytofotometri till flödescytometri , en term som snabbt blev populär. Vid den tidpunkten hade pulscytofotometri utvecklats till den moderna formen av flödescytometri, pionjär av Van Dilla tio år tidigare. [ citat behövs ]
Se även
externa länkar
- Cytometry Volume 10 av Purdue University Cytometry Laboratories