Hemocytometer
Hemocytometern (eller hemocytometern) är en räknekammare som ursprungligen utformades och används vanligtvis för att räkna blodkroppar .
Hemocytometern uppfanns av Louis-Charles Malassez och består av ett tjockt glasmikroskopobjektglas med en rektangulär fördjupning som skapar en precisionsvolymkammare. Denna kammare är graverad med ett laseretsat rutnät av vinkelräta linjer. Anordningen är noggrant utformad så att området som begränsas av linjerna är känt, och djupet på kammaren är också känt. Genom att observera ett definierat område av rutnätet är det därför möjligt att räkna antalet celler eller partiklar i en specifik vätskevolym och därigenom beräkna koncentrationen av celler i vätskan totalt sett. En väl använd typ av hemocytometer är Neubauer- räknekammaren.
Andra typer av hemocytometrar med olika utslag används för olika tillämpningar. Fuchs-Rosenthal-utslag, vanligtvis används för räkning av ryggmärgsvätskor, Howard-mögelutslag som används för mögel på livsmedel och livsmedelsförpackningar, McMaster Egg Slide-utslag som används för att räkna mikrobiella ägg i fekalt material, Nageotte-kammarens utslag för att räkna låga nivåer av vita blodkroppar cellreducerade trombocytkomponenter, Palmer Nanoplankton-utslag för räkning av mindre plankter. Petroff-Hausser-räknare med förbättrade Neubauer-utslag används för bakterier och spermier och erbjuds med varierande kammardjup. Sedgwick-Rafter Cell-domen i en hemocytometer är i första hand utformad för användning i mikroskopi av dricksvatten.
Principer
Rutnätsytan på Improved Neubauer ruled hemocytometer består av nio 1 x 1 mm (1 mm 2 ) rutor. Dessa är indelade i tre riktningar; 0,25 x 0,25 mm (0,0625 mm 2 ), 0,25 x 0,20 mm (0,05 mm 2 ) och 0,20 x 0,20 mm (0,04 mm 2 ). Den centrala kvadraten är ytterligare uppdelad i 0,05 x 0,05 mm (0,0025 mm 2 ) kvadrater. De upphöjda kanterna på hemocytometern håller täckglaset 0,1 mm från det markerade rutnätet, vilket ger varje ruta en definierad volym (se bilden till höger).
| Mått | Område | Volym på 0,1 mm djup |
|---|---|---|
| 1 x 1 mm | 1 mm 2 | 100 nL |
| 0,25 x 0,25 mm | 0,0625 mm 2 | 6,25 nL |
| 0,25 x 0,20 mm | 0,05 mm 2 | 5 nL |
| 0,20 x 0,20 mm | 0,04 mm 2 | 4 nL |
| 0,05 x 0,05 mm | 0,0025 mm 2 | 0,25 nL |
Användande
För att använda hemocytometern, se först till att det speciella täckglaset som medföljer räknekammaren är korrekt placerat på ytan av räknekammaren. När de två glasytorna är i ordentlig kontakt Newtons ringar observeras. Om så är fallet, appliceras cellsuspensionen på kanten av täckglaset för att sugas in i tomrummet genom kapillärverkan som helt fyller kammaren med provet. Antalet celler i kammaren kan bestämmas genom direkt räkning med hjälp av ett mikroskop , och visuellt urskiljbara celler kan räknas differentiellt. Antalet celler i kammaren används för att beräkna koncentrationen eller densiteten av cellerna i blandningen provet kommer ifrån. Det är antalet celler i kammaren dividerat med kammarens volym, som är känt från början, med hänsyn till eventuella utspädningar och räknegenvägar:
där volymen av det utspädda provet (efter spädning) dividerat med volymen av den ursprungliga blandningen i provet (före utspädning) är utspädningsfaktorn . Till exempel, om volymen av den ursprungliga blandningen var 20μL och den späddes ut en gång (genom att tillsätta 20μL spädningsmedel), är den andra termen inom parentes 40μL/20μL. Volymen på de räknade kvadraterna är den som visas i tabellen överst, beroende på storleken (se bilden till höger). Antalet celler som räknas är summan av alla celler räknade över rutor i en kammare. Andelen av cellerna som räknas gäller om inte alla inre rutor inom en uppsättningsruta räknas (dvs. om bara 4 av de 20 i en hörnruta räknas, kommer denna term att vara lika med 0,2). När man räknar stora kvadrater med en volym på 100 nanoliter (nL) leder en multiplikation med 10000 till önskat cellantal per milliliter.
För de flesta applikationer används endast de fyra stora hörnrutorna. Cellerna som finns på eller vidrör de övre och vänstra linjerna räknas, men de på eller vidrör den högra eller nedre raden ignoreras.
Krav
Den ursprungliga suspensionen måste blandas noggrant innan ett prov tas. Detta säkerställer att provet är representativt, och inte bara en artefakt av den speciella regionen av den ursprungliga blandningen den togs från.
En lämplig utspädning av blandningen med hänsyn till antalet celler som ska räknas bör användas. Om provet inte späds tillräckligt blir cellerna för trånga och svåra att räkna. Om den är för utspädd kommer provstorleken inte att räcka till för att dra starka slutsatser om koncentrationen i den ursprungliga blandningen.
Genom att utföra ett redundant test på en andra kammare kan resultaten jämföras. Om de skiljer sig mer än 2 gånger räknefelet (kvadratroten av räkningen), kan metoden för att ta provet vara opålitlig (t.ex. är den ursprungliga blandningen inte blandad ordentligt).
Räknekammaren ska fyllas med kapillärverkan efter att kammarlocket (speciellt täckglas med certifierad tjocklek och planhet) har satts på plats. Detta undviker risken att cellerna kan sedimentera/fastna på glaset eller att någon volym avdunstar innan täckglaset placeras ovanpå och resultera i en överskattning av cellkoncentrationen. Sedimentering är ett mindre problem med bakterier men avdunstning, som är vanligare i luftkonditionerade laboratorier med låg luftfuktighet, måste fortfarande minimeras.
Ansökningar
- Blodvärden : för patienter med onormala blodkroppar, där automatiserade räknare inte fungerar bra.
- Spermier räknas
- Urinmikroskopi
- Cellodling: vid subodling eller registrering av celltillväxt över tid.
- Ölbryggning : för beredning av jäst.
- Växtplanktoncellräkning _
- Cellbearbetning för nedströmsanalys: exakta cellantal behövs i många tester ( PCR , flödescytometri ), medan vissa andra kräver hög cellviabilitet.
- Mätning av cellstorlek: i ett mikrofotografi kan den verkliga cellstorleken utläsas genom att skala den till bredden på en hemocytometerkvadrat, vilket är känt.
externa länkar
- Onlineträning - Jästräkningar i Neubauer förbättrade eller Thoma-räkningskammare
- Hemocytometer-kalkylator online
- Typer av hemocytometrar