CyTOF
Cytometri by time of flight , eller CyTOF , är en tillämpning av masscytometri som används för att kvantifiera märkta mål på ytan och insidan av enstaka celler. CyTOF tillåter kvantifiering av flera cellulära komponenter samtidigt med hjälp av en ICP-MS- detektor.
CyTOF drar fördel av immunmärkning för att kvantifiera proteiner , kolhydrater eller lipider i en cell. Mål väljs för att svara på en specifik forskningsfråga och är märkta med lantanidmetallmärkta antikroppar. Märkta celler nebuliseras och blandas med uppvärmd argongas för att torka cellen som innehåller partiklar. Prov-gasblandningen fokuseras och antänds med en argonplasmabrännare . Detta bryter upp cellerna i sina individuella atomer och skapar ett jonmoln. Rikliga lågviktsjoner som genereras från omgivningsluft och biologiska molekyler avlägsnas med hjälp av en kvadrupol massanalysator . De återstående tunga jonerna från antikroppstaggarna kvantifieras med Time-of-flight masspektrometri . Jonförekomster korrelerar med mängden mål per cell och kan användas för att sluta sig till cellulära kvaliteter.
Masspektrometrins känslighet för att detektera olika joner tillåter mätningar av uppemot 50 mål per cell samtidigt som man undviker problem med spektral överlappning vid användning av fluorescerande prober. Men denna känslighet betyder också att spår av tungmetaller är ett problem. Användning av ett stort antal sönder skapar nya problem vid analys av de högdimensionella data som genereras.
Historia
1994 utförde Tsutomu Nomizu och kollegor vid Nagoya University de första masspektrometriexperimenten med enstaka celler. Nomizu insåg att enstaka celler kunde nebuliseras, torkas och antändas i plasma för att generera moln av joner som kunde detekteras med emissionsspektrometri. I denna typ av experiment kunde element som kalcium i cellen kvantifieras. Inspirerad av flödescytometri byggde Scott D. Tanner 2007 på denna ICP-MS med den första multiplexade analysen med lantanidmetaller för att märka DNA och cellytmarkörer. Under 2008 beskrev Tanner tandemfästning av en flödescytometer till en ICP-MS-maskin samt nya antikroppstaggar som skulle möjliggöra massiv multiplexerad analys av cellmarkörer. Genom att ytterligare optimera detektionshastigheten och känsligheten för denna flödeskopplade ICP-MS-maskin byggde de den första CyTOF-maskinen.
CyTOF-maskinen ägdes ursprungligen av det kanadensiska företaget DVS Sciences men är nu den exklusiva produkten av Fluidigm efter deras förvärv 2014 av DVS sciences. 2022 fick Fluidigm en capitolinfusion och bytte namn till Standard BioTools. Det har förekommit 4 iterationer av CyTOF-apparaten med namnet CyTOF, CyTOF2, Helios™ och CyTOF XT. De successiva förbättringarna gällde till stor del ökat detektionsområde och mjukvaruparametrar med Helios-maskinen som kunde detektera från metaller från yttrium-89 till vismut-209 och genomströmning och analysera 2000 händelser per minut.
Arbetsflöde
Lantanidgruppen av element används för att märka antikroppar , eftersom bakgrunden i biologiska prover är mycket låg . När man väljer lämplig isotop för biomarkören, bör lågexpressionsbiomarkörer paras med en isotop som har hög signalintensitet. Om en mindre ren isotop måste användas, bör den paras ihop med en biomarkör med lågt uttryck för att minimera eventuell ospecifik bindning eller bakgrund.
Isotoppolymerer konstrueras med dietylentriaminpentaättiksyra (DTPA) kelator för att binda samman joner. Polymeren avslutas med en tiol eller en maleimid som länkar den till reducerade disulfider i antikroppens Fc-region. Fyra till fem polymerer är bundna till en antikropp, vilket resulterar i cirka 100 isotopatomer per antikropp. Märkade antikroppar kan vara i lösning, konjugerade till pärlor eller ytimmobiliserade. Cellfärgningen följer samma procedurer som vid fluorescerande färgning för flödescytometri.
För att skilja mellan levande och döda celler kan celler sonderas med rodium , en interkalator som bara kan penetrera döda celler. Sedan fixeras alla celler och färgas med iridium , som penetrerar alla celler, för att kunna visualisera vilka som lever.
Cellinförandemetoden för masscytometern är en aerosolsplitterinjektion. Cellerna fångas sedan in i en ström av argongas och transporteras sedan till plasmat där de förångas, finfördelas och joniseras. Cellen är nu ett moln av joner, som passerar in i jonoptikcentret. Sedan används en tidsanalysator för att mäta jonernas massa.
Dataanalys
Joner accelereras genom spektrometern i pulser. Elektronmolnet som genereras från en enda cell är vanligtvis 10-150 pulser. Utdata från en Helios™-körning är en binär integrerad massdatafil (IMD) som innehåller elektronintensiteter mätta från jonerna för varje masskanal. De kontinuerliga pulserna måste lösas upp i individuella cellhändelser som motsvarar jonmolnet som genereras från en cell. Varje fack med mellan 10-150 pulser som passerar den användarinställda lägre faltningströskeln, anses vara en cellhändelse av Helios™-mjukvaran. Den lägre faltningströskeln är det minimala jonantal som måste nås över alla jonkanaler för att betraktas som en cellhändelse. Värdet för denna parameter ökar med antalet joner som mäts och därför krävs fler räkningar för att definiera en cellhändelse när fler etiketter används.
För dataanalys konverteras IMD-filen till formatet flödescytometristandard ( FCS). Denna fil innehåller det totala antalet joner för varje kanal för varje cell arrangerad i en matris och är samma fil som genereras under flödescytometri . Manuell gating av dessa data kan utföras som görs för flödescytometri och de flesta verktyg som finns tillgängliga för flödescytometrianalys har porterats till CyTOF (Se flödescytometri bioinformatik) . CyTOF-data är vanligtvis högdimensionella . För att avgränsa samband mellan cellpopulationer används ofta dimensionsreduktionsalgoritmer . Flera multidimensionella analysklustringsalgoritmer är vanliga. Populära verktyg inkluderar tSNE , FlowSOM och diffusionspseudotiden (DPT). Nedströmsanalysmetoderna beror på forskningsmålen.
Ansökningar
CyTOF tillhandahåller viktig information på en cellnivå om proteinuttryck, immunfenotyp och funktionell karakterisering. Det är ett värdefullt verktyg inom immunologi , där det stora antalet parametrar har hjälpt till att belysa hur detta komplexa system fungerar. Till exempel naturliga mördarceller olika egenskaper som påverkas av många markörer i olika kombinationer, som inte kunde analyseras med lätthet före denna teknik. Att samtidigt mäta många biomarkörer gör det möjligt att identifiera över 30 distinkta immunfenotypundergrupper inom en komplex grupp av celler. Detta kan hjälpa till att mer fullständigt karakterisera immunfunktion, infektionssjukdomar och cancer, och förstå cellers svar på terapi.
Fördelar och nackdelar
Den stora fördelen med CYTOF är möjligheten att undersöka ett större antal parametrar per panel än andra cytometrimetoder. Detta möjliggör en större förståelse för komplexa och heterogena cellpopulationer, utan behov av många komplexa och överlappande paneler. Paneler kan innehålla upp till 45 antikroppar, till skillnad från de 10 som kan göras i konventionell flödescytometri men kräver stor expertis för att designa. Utvecklingen av spektralflödescytometri har emellertid stängt gapet mellan flödes- och masscytometri i termer av det maximala antalet antikroppar som kan användas. Fler antikroppar per panel sparar tid, tillåter förståelse av en större bild och kräver färre antal celler per experiment, vilket är särskilt fördelaktigt när proverna är begränsade, såsom med tumörstudier.
Användningen av tungmetallisotoperna sänker också bakgrunden jämfört med att använda fluorescerande antikroppar. Vissa celltyper, såsom myeloidceller, har höga frekvenser av autofluorescens som skapar mycket bakgrundsljud vid flödescytometri. De sällsynta tungmetallisotoperna som används finns dock inte i biologiska system, därför ses mycket liten eller ingen bakgrund, och den totala känsligheten ökar. Detekteringsöverlappningen mellan de olika tungmetallerna är också mycket låg jämfört med överlappningen som ses i fluorescerande cytometri, vilket gör det mycket enklare att utforma en panel med många markörer.
Fluorescerande färgämnen är föremål för fotoblekning, vilket kräver att hela processen sker inom några timmar efter färgning. Metallmärkta antikroppar är dock livskraftiga i upp till två veckor utan att förlora signal, vilket ger mer flexibilitet till experiment. De färgade proverna kan också kryokonserveras, vilket kan vara särskilt användbart för kliniska prövningar när prover samlas in under en längre tidsperiod.
Kostnaderna för CyTOF är höga, eftersom de metallmärkta antikropparna och antikroppskonjunktionssatserna är dyra. En stor nackdel med CyTOF är att insamlingsflödeshastigheten är ganska långsam jämfört med flödescytometri, med nästan en storleksordning. Eftersom tungmetaller är vanliga i laboratoriereagenser är det mycket viktigt att undvika kontaminering under provberedningen.