Bakteriefritt djur
Bakteriefria organismer är flercelliga organismer som inte har några mikroorganismer som lever i eller på sig. Sådana organismer föds upp med olika metoder för att kontrollera deras exponering för virala , bakteriella eller parasitära medel. När känd mikrobiota introduceras till en bakteriefri organism kallas den vanligtvis för en gnotobiotisk organism , men tekniskt sett är bakteriefria organismer också gnotobiotiska eftersom statusen för deras mikrobiella samhälle är känd . På grund av att de saknar mikrobiom uppvisar många bakteriefria organismer hälsobrister såsom defekter i immunsystemet och svårigheter med energiupptagning. Typiskt bakteriefria organismer används i studien av en mikrobiom där noggrann kontroll av yttre föroreningar krävs.
Generation och odling
Bakteriefria organismer genereras på en mängd olika sätt, men en vanlig praxis som delas av många av dem är någon form av steriliseringssteg följt av avskildhet från den omgivande miljön för att förhindra kontaminering .
Fjäderfän
Bakteriefria fjäderfän genomgår vanligtvis flera steriliseringssteg medan de fortfarande är i ägglivsstadiet. Detta kan innebära antingen tvättning med blekmedel eller en antibiotikalösning för att ytsterilisera ägget. Äggen överförs sedan till en steril inkubator där de odlas tills de kläcks. När de väl kläckts förses de med steriliserat vatten och ett gammabestrålat foder. Detta förhindrar införandet av främmande mikrober i deras tarmkanal. Inkubatorerna och djurens avfallsprodukter övervakas kontinuerligt för eventuell kontaminering. Vanligtvis, när det används i experiment, introduceras ett känt mikrobiom till djuren vid några dagars ålder. Kontaminering övervakas och kontrolleras fortfarande efter denna punkt, men närvaron av mikrober förväntas.
Möss
Möss genomgår en något annorlunda process på grund av att de saknar ett ägglivsstadium. För att skapa en bakteriefri mus skapas ett embryo genom provrörsbefruktning . och transplanteras sedan till en bakteriefri mamma Om denna metod inte är tillgänglig kan en mus födas genom kejsarsnitt , men detta medför en högre risk för kontaminering. Denna process använder en icke-bakteriefri mamma som offras och steriliseras före ungarnas födelse. Efter kejsarsnittet ska ungarna sedan föras över till en steril kuvös med en bakteriefri mamma för utfodring och tillväxt. Dessa metoder krävs endast för att skapa en bakteriefri muslinje. När en linje har genererats kommer all avkomma att vara bakteriefri om den inte är kontaminerad. Dessa avkommor kan sedan användas för experiment. Typiskt för experiment är varje mus inrymd separat i en steril isolator för att förhindra korskontaminering mellan möss. Mössen förses med steriliserad mat och vatten för att förhindra kontaminering. Steriliseringsmetoderna kan variera mellan experiment på grund av olika dieter eller droger mössen utsätts för. Isolatorerna och avfallsprodukterna övervakas kontinuerligt för eventuell kontaminering för att säkerställa fullständig sterilitet. Som med fjäderfä kan en känd mikrobiom introduceras i djuren men kontaminering övervakas fortfarande för.
Nematoder
Nematoder kan också odlas bakteriefria. Bakteriefria avkommor av nematoden C. elegans , som används i forskning, kan framställas genom att vuxna maskar spricker för att frigöra ägg. Standardmetoden för detta är att introducera en population av vuxna maskar till en blekmedelslösning. Denna blekmedelslösning bryter de vuxna maskarna, bryter ner dem samtidigt som de släpper och ytsteriliserar eventuella ägg. De steriliserade äggen tvättas och överförs till en platta med agar som innehåller mat för maskarna. C. elegans konsumerar bakterier, så innan äggen kan överföras till tallriken måste maten dödas av antingen värme eller bestrålning. Denna metod för att skapa bakteriefria nematoder har den extra fördelen att ålderssynkronisera maskarna, så att de alla är i samma åldrar när de växer. Vanligtvis måste maskarna överföras till en ny tallrik eftersom de konsumerar all mat på den nuvarande tallriken, och varje tallrik har också behandlats med värme eller strålning. Plattorna kan skyddas från yttre föroreningar genom att täcka dem och isolera dem från möjliga föroreningskällor.
Växter
Frön ytsteriliseras med kemikalier, såsom etanol eller en antibiotikalösning, för att producera en bakteriefri växt. Fröna odlas sedan i vatten eller annat medium tills de gror. Efter groning överförs fröna till antingen steril jord eller jord med en specifik mikrobiota för användning i experiment. Frön kan också överföras direkt till jorden och tillåtas gro. Om växterna överförs till steril jord finns det vanligtvis två typer av tillväxtmetoder. Den första är där hela växten hålls steril och i den andra hålls endast rotsystemet sterilt. Metoden väljs utifrån kraven för experimentet. Växterna odlas i isolatorer som ofta kontrolleras för föroreningar tillsammans med jorden som växterna växer i.
Fruktflugor
Fruktflugor, speciellt Drosophila -arterna, har varit en av de mest använda modellorganismerna . Drosophila-arter har mestadels använts inom genetikområdet . Det finns två huvudsakliga metoder för att ge gnotobiotiska eller axeniska flugor. En av dem är att samla in äggen och dekorionera dem. En chorion är det yttre membranet runt embryot. Under aseptiska förhållanden tvättas äggen två gånger under 2,5 minuter vardera, i 0,6% natriumhypokloritlösning. De placeras sedan med provkoppen i 90 ml blekmedel. Efter detta tvättas de tre gånger i sterilt vatten. De koronerade äggen placeras sedan i flaskor som innehåller steril diet.
Den andra metoden är genom användning av antibiotika . Medier, såsom vanlig jäst-majsmjölsdiet, kompletteras med streptomycin eller en kombination av antibiotika. Koncentrationen av antibiotikan är 400 μg/ml. När jäst-majsmjölsdieten har svalnat tillsätts 4 ml lösning innehållande 10 g streptomycin löst i 100 ml etanol per liter mat. Mediet hälls sedan i flaskor och de nyskördade äggen överförs till flaskorna.
Hälsoeffekter på organismen
På grund av att de saknar en hälsosam mikrobiom uppvisar många bakteriefria organismer stora hälsobrister. De metoder som används för att producera bakteriefria organismer kan också ha negativa bieffekter på organismen. Minskad kläckningshastighet observerades i kycklingägg inkuberade med kvicksilverklorid , medan behandling med perättiksyra inte orsakade någon signifikant effekt på kläckningshastigheten. Kycklingarna uppvisade också defekter i tunntarmens tillväxt och hälsa. Bakteriefria möss har visat sig ha defekter i immunförsvaret och energiupptaget på grund av att de saknar en frisk mikrobiom. Det finns också starka bevis för interaktioner mellan musmikrobiomet och dess hjärnans utveckling och hälsa. Groddfria växter uppvisar allvarliga tillväxtdefekter på grund av att de saknar symbionter som ger nödvändiga näringsämnen till dem.
Används
Mikrobiomforskning
Bakteriefria djur används rutinmässigt för att fastställa kausalitet i studier av mikrobiomet. Detta görs genom att jämföra djur med en vanlig kommensalt tarmmikrobiom med bakteriefritt, eller genom att kolonisera ett bakteriefritt djur med en organism av intresse. Tarmmikrobiotan kan variera mellan forskningsanläggningar vilket kan vara en förvirring i experiment och vara en orsak till bristande reproducerbarhet. Flera kontrollmikrobiomer har utvecklats som korrigerar de stora hälsofel som vanligtvis förekommer hos bakteriefria djur och kan fungera som en reproducerbar kontrollgemenskap. Bakteriefria djur har använts för att visa en kausal roll för tarmmikrobiomet i olika miljöer som neural utveckling , livslängd, cancerimmunterapi och många andra hälsorelaterade sammanhang.