Ammoniumsulfatutfällning

Ammoniumsulfatfällning är en av de mest använda metoderna för proteinrening och fraktionering i stor och laboratorieskala som kan användas för att separera proteiner genom att ändra deras löslighet i närvaro av en hög saltkoncentration.

Egenskaper

Ammoniumsulfat är ett oorganiskt salt med hög löslighet som dissocierar till ammonium ( NH
⁺ ₄ ) och sulfat ( SO
²⁻ ₄ ) i vattenlösningar. Ammoniumsulfat är särskilt användbart som utfällningsmedel eftersom det är mycket lösligt, stabiliserar proteinstrukturen, har en relativt låg densitet, är lättillgängligt och är relativt billigt.

Mekanism

Ammoniumsulfat, såväl som andra neutrala salter, kommer att stabilisera proteiner genom preferentiell solvatisering . Proteiner lagras vanligtvis i ammoniumsulfat eftersom det hämmar bakterietillväxt. Med tillsats av ammoniumsulfat kan proteiner som vecklas ut av denatureringsmedel pressas in i sina naturliga konformationer. Detta kan ses med veckningen av rekombinanta proteiner.

Lösligheten hos proteiner varierar beroende på lösningens jonstyrka, alltså beroende på saltkoncentrationen. Vid låga jonkoncentrationer (mindre än 0,5 mol/L) ökar proteinernas löslighet med ökande saltkoncentration, en effekt som kallas " insaltning ". När saltkoncentrationen ökas ytterligare börjar proteinets löslighet att minska. Vid en tillräckligt hög jonstyrka kommer proteinet att falla ut ur lösningen, en effekt som kallas " utsaltning ". När ammonium- ( NH
⁺ ₄ ) och sulfat- ( SO
²⁻ ₄ ) joner finns i vattenlösningen attraheras de till motsatta laddningar som är uppenbara på föreningen som renas. Denna attraktion av motsatta laddningar hindrar vattenmolekylerna från att interagera med föreningen som renas, vilket leder till utfällning eller "utsaltning".

Proteiner skiljer sig markant i deras löslighet vid hög jonstyrka, därför är "utsaltning" en mycket användbar procedur för att hjälpa till vid reningen av det önskade proteinet. Ammoniumsulfat används vanligtvis för utfällning på grund av dess höga löslighet, dessutom bildar det två joner höga i Hofmeister-serien . Eftersom dessa två joner är i slutet av Hofmeister-serien, kan ammoniumsulfat också stabilisera en proteinstruktur. Ammoniumsulfatlöslighetsbeteendet för ett protein uttrycks vanligtvis som en funktion av mättnadsprocenten. En löslighetskurva kan bestämmas genom att plotta logaritmen för den experimentellt bestämda lösligheten, uttryckt som mg/ml, mot den procentuella mättnaden av ammoniumsulfat.

Med mekanismen för utsaltning, utelämnas saltet från vattenlagret, som är nära förknippat med proteinets yta, känt som hydratiseringsskiktet. Hydratiseringsskiktet spelar en viktig roll för att upprätthålla löslighet och lämplig naturlig konformation. Det finns tre huvudsakliga protein-vatten-interaktioner: jonhydrering mellan laddade sidokedjor, vätebindning mellan polära grupper och vatten och hydrofob hydrering. När salt väl tillsätts till blandningen sker en ökning av vattnets ytspänning, vilket ökar hydrofoba interaktioner mellan vatten och proteinet av intresse. Proteinet av intresse minskar sedan dess yta, vilket minskar dess kontakt med lösningsmedlet. Detta visas av veckningen och självassociationen, vilket i slutändan leder till nederbörd. Proteinets veckning och självassociering pressar ut fritt vatten, vilket leder till en ökning av entropin och gör denna process energetiskt gynnsam.

Procedur

Vanligtvis ökas ammoniumsulfatkoncentrationen stegvis och det utfällda proteinet utvinns i varje steg. Detta görs vanligtvis genom att tillsätta fast ammoniumsulfat; dock kan det vara svårt att beräkna mängden ammoniumsulfat som bör tillsättas för att tillsättas till en lösning för att uppnå den önskade koncentrationen eftersom tillsatsen av ammoniumsulfat väsentligt ökar volymen av lösningen. Mängden ammoniumsulfat som bör tillsättas till lösningen kan bestämmas från publicerade nomogram eller genom att använda en online-kalkylator. Den direkta tillsatsen av fast ammoniumsulfat ändrar lösningens pH, vilket kan leda till förlust av enzymaktivitet. I dessa fall används tillsats av mättat ammoniumsulfat i en lämplig buffert som ett alternativ till fast ammoniumsulfat. I båda tillvägagångssätten kan den resulterande proteinfällningen lösas individuellt i en standardbuffert och analyseras för att bestämma det totala proteininnehållet.

Den tillsatta ammoniumsulfatkoncentrationen bör ökas till ett värde som kommer att fälla ut det mesta av proteinet av intresse samtidigt som den maximala mängden proteinföroreningar kvarstår i lösningen. Det utfällda proteinet av intresse kan därefter utvinnas genom centrifugering och lösas i standardbuffert för att förbereda provet för nästa reningssteg.

I nästa steg av reningen måste allt detta tillsatta salt avlägsnas från proteinet. Ett sätt att göra det är att använda dialys, men dialys späder ut det koncentrerade proteinet ytterligare. Det bättre sättet att ta bort ammoniumsulfat från proteinet är att blanda fällningsproteinet i en buffert innehållande en blandning av SDS, Tris-HCl och fenol och centrifugera blandningen. Fällningen som kommer ut från denna centrifugering kommer att innehålla saltfritt koncentrerat protein.

Ansökningar

Ammoniumsulfatfällning är en användbar teknik som ett första steg i proteinrening eftersom det möjliggör snabb bulkfällning av cellulära proteiner. Det används också ofta under de senare stadierna av reningen för att koncentrera protein från utspädd lösning enligt procedurer som gelfiltrering . Nackdelen med denna metod är att olika ämnen ofta kan fällas ut tillsammans med proteinet, och andra reningstekniker måste utföras, såsom jonkromatografi eller storleksuteslutningskromatografi .