Agroinfiltration
Agroinfiltration är en metod som används inom växtbiologi och särskilt på senare tid inom växtbioteknik för att inducera övergående uttryck av gener i en växt , eller isolerade löv från en växt, eller till och med i kulturer av växtceller, för att producera ett önskat protein . I metoden införs en suspension av Agrobacterium tumefaciens i ett växtblad genom direkt injektion eller genom vakuuminfiltration, eller bringas i association med växtceller immobiliserade på ett poröst underlag (växtcellsförpackningar), varefter bakterierna överför den önskade genen till växtceller via överföring av T -DNA . Den största fördelen med agroinfiltration jämfört med den mer traditionella växttransformationen är hastighet och bekvämlighet, även om utbytena av det rekombinanta proteinet i allmänhet också är högre och mer konsekventa.
Det första steget är att introducera en gen av intresse för en stam av Agrobacterium tumefaciens . Därefter odlas stammen i en flytande kultur och de resulterande bakterierna tvättas och suspenderas i en lämplig buffertlösning . För injektion placeras denna lösning sedan i en spruta (utan nål). Spetsen på sprutan pressas mot undersidan av ett blad samtidigt som ett försiktigt mottryck appliceras på den andra sidan av bladet. Agrobacterium - suspensionen injiceras sedan i luftrummen inuti bladet genom stomata , eller ibland genom ett litet snitt på undersidan av bladet.
Vakuuminfiltration är ett annat sätt att introducera Agrobacterium djupt in i växtvävnaden. I denna procedur nedsänks bladskivor, löv eller hela växter i en bägare som innehåller lösningen, och bägaren placeras i en vakuumkammare. Vakuumet appliceras sedan, vilket tvingar ut luft ur de intercellulära utrymmena i bladen via stomata. När vakuumet släpps, tvingar tryckskillnaden "Agrobacterium"-suspensionen in i bladen genom stomata in i mesofyllvävnaden . Detta kan resultera i att nästan alla celler i ett visst blad kommer i kontakt med bakterierna.
Väl inne i bladet förblir Agrobacterium i det intercellulära utrymmet och överför genen av intresse som en del av det Ti-plasmid-härledda T-DNA:t i högt antal kopior till växtcellerna. Genöverföringen sker när växtsignalerna induceras och fysisk kontakt görs mellan växtcellerna och bakterierna. Bakterierna skapar en mekanism som gräver ett hål och överför den nya T-DNA-strängen till växtcellen. T-DNA:t rör sig in i växtens kärna och börjar integreras i växternas kromosom. Genen uttrycks sedan övergående genom RNA-syntes från lämpliga promotorsekvenser i alla transfekterade celler (ingen selektion för stabil integration utförs). Växten kan övervakas för en möjlig effekt i fenotypen , utsättas för experimentella förhållanden eller skördas och användas för rening av proteinet av intresse. Många växtarter kan bearbetas med denna metod, men de vanligaste är Nicotiana benthamiana och mer sällan Nicotiana tabacum .
Övergående uttryck i odlade växtcellsförpackningar är en ny procedur, nyligen patenterad av Fraunhofer Institute IVV, Tyskland. För denna teknik immobiliseras suspensionsodlade celler av tobak (t.ex. NT1- eller BY2-cellinjer av Nicotiana tabacum ) genom filtrering på ett poröst underlag för att bilda en välluftad cellförpackning, och inkuberas sedan med rekombinant Agrobacterium under en tid för att tillåta T- DNA-överföring, före återfiltrering för att avlägsna överskott av bakterier och vätska. Inkubation av cellpaketet i en fuktig miljö under tidsperioder upp till flera dagar tillåter övergående uttryck av protein. Utsöndrade proteiner kan tvättas ut ur cellpaketet genom applicering av buffert och ytterligare filtrering.
Tystnadsdämpare vid agroinfiltration
Det är ganska vanligt att samfiltrera Agrobacterium som bär konstruktionen av intresse tillsammans med en annan Agrobacterium som bär en tystande suppressorproteingen som den som kodar för p19-proteinet från det växtpatogena Tomato bushy stuntviruset (TBSV), eller NSs-proteinet från tomatfläckig vissnesjuka virus (TSWV). TBSV upptäcktes första gången 1935 i tomater och resulterar i plantor med hämmad tillväxt och deformerade frukter. TSWV upptäcktes i tomater i Australien 1915 och var under många år den enda medlemmen av det som nu är känt som släktet Tospovirus , familjen Bunyaviridae .
För att försvara sig mot virus och andra patogener som introducerar främmande nukleinsyror i sina celler har växter utvecklat ett system med post-transkriptionell gentystnad (PTGS) där små störande RNA produceras från dubbelsträngat RNA för att skapa en sekvens specifik nedbrytningsväg som effektivt tystar icke-infödda gener. Många växtvirus har utvecklat mekanismer som motverkar växternas PTGS-system genom att utveckla proteiner, såsom p19 och NSs, som interfererar med PTGS-vägen på olika nivåer.
Även om det inte är klart exakt hur p19 fungerar för att undertrycka RNA-tystnad, har studier visat att tillfälligt uttryckta proteiner i Nicotiana benthamiana -blad har ett upp till 50 gånger högre utbyte när de samfiltreras med TBSV p19.
TSWV och andra tospovirus NSs-proteiner har visat sig vara effektiva som suppressorer av både lokal och systemisk tystnad, och kan vara ett användbart alternativ till p19 där det senare har visat sig inte vara effektivt. I andra studier har p19 från kronärtskocka fläckigt crinkle-virus visat sig ha en liknande, men svagare, effekt som TBSV p19.