Φ29 DNA-polymeras

DNA-
polymerasidentifierare
Organism	Bacillus fag phi29
Symbol	2
UniProt	P03680
Söka efter Strukturer Schweizisk modell Domäner InterPro

DNA-polymeras typ B, organellära och virala, phi29-liknande
identifierare
Symbol	DNA_pol_B_2
Pfam	PF03175
InterPro	IPR014416
SCOP2	2py5 / SCOPe / SUPFAM
Tillgängliga proteinstrukturer: Pfam   strukturer / ECOD   PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj PDBsumma struktur sammanfattning

Φ29 DNA-polymeras är ett enzym från bakteriofagen Φ29 . Det används alltmer inom molekylärbiologi för multipla förskjutnings-DNA-amplifieringsprocedurer , och har ett antal funktioner som gör det särskilt lämpligt för denna applikation. Den upptäcktes och karakteriserades av de spanska forskarna Luis Blanco och Margarita Salas .

Φ29 DNA-replikation

Φ29 är en bakteriofag av Bacillus subtilis med ett sekvenserat, linjärt, 19 285 baspar DNA-genom. Varje 5'-ände är kovalent kopplad till ett terminalt protein, vilket är väsentligt i replikationsprocessen genom att fungera som en primer för det virala DNA-polymeraset. Ett symmetriskt sätt för replikation har föreslagits, varvid protein-primad initiering sker icke-samtidigt från vardera änden av kromosomen; detta involverar två replikationsursprung och två distinkta polymerasmonomerer. Syntesen är kontinuerlig och involverar en strängförskjutningsmekanism. Detta demonstrerades av enzymets förmåga att fortsätta att kopiera det enkelprimade cirkulära genomet av M13-fagen mer än tio gånger i en enkelsträng (över 70 kb i en enkelsträng). In vitro-experiment har visat att Φ29-replikation kan fortsätta till komplettering med de enda fagproteinkraven för polymeraset och det terminala proteinet. Polymeraset katalyserar bildningen av initieringskomplexet mellan det terminala proteinet och kromosomändarna vid en adeninrest. Härifrån kan kontinuerlig syntes ske.

Polymeraset

Polymeraset är ett monomert protein med två distinkta funktionella domäner. Platsstyrda mutagenesexperiment stöder påståendet att detta protein uppvisar en strukturell och funktionell likhet med Klenow-fragmentet av Escherichia coli polymeras I-enzymet; den innefattar en C-terminal polymerasdomän och en rumsligt separerad N-terminal domän med en 3'-5' exonukleasaktivitet .

Det isolerade enzymet har ingen inneboende helikasaktivitet , men kan utföra en ekvivalent funktion genom sin starka bindning till enkelsträngat DNA , i synnerhet framför dubbelsträngad nukleinsyra. Detta är egenskapen hos detta enzym som gör att det är gynnsamt applicerbart på Multiple Displacement Amplification . Enzymet underlättar "avgrening" av dubbelsträngat DNA. Deoxiribonukleosidtrifosfatklyvning som sker som en del av polymerisationsprocessen tillför förmodligen den energi som krävs för denna avlindningsmekanism . Den kontinuerliga karaktären av strängsyntes (jämfört med den asymmetriska syntesen som ses i andra organismer) bidrar förmodligen till denna förbättrade processivitet. Korrekturläsningsaktivitet som förlänas av exonukleasdomänen demonstrerades genom att visa den föredragna excisionen av en felmatchad nukleotid från 3'-änden av den nyligen syntetiserade strängen. Enzymets exonukleasaktivitet är, liksom dess polymerisationsaktivitet, mycket processiv och kan bryta ned enkelsträngade oligonukleotider utan dissociation. Samarbete eller en "känslig konkurrens" mellan dessa två funktionella domäner är väsentligt för att säkerställa korrekt förlängning med en optimal hastighet. Exonukleasaktiviteten hos enzymet hämmar dess polymerisationskapacitet; inaktivering av exonukleasaktiviteten genom platsriktad mutagenes innebar att en 350 gånger lägre dNTP-koncentration krävdes för att uppnå samma hastigheter av primerförlängning som ses i vildtypsenzymet .

Helgenomförstärkning

Φ29-polymerasenzym används redan i multiple displacement amplification (MDA) procedurer (inklusive i ett antal kommersiella kit) där fragment tiotals kilobaser långa kan produceras från icke-specifika hexameriska primrar som hybridiserar med intervaller längs genomet. Enzymet har många önskvärda egenskaper som gör det lämpligt för helgenomamplifiering (WGA) med denna metod.

• Hög processivitet.
• Korrekturläsningsaktivitet. Det antas vara 1 eller 2 storleksordningar mindre felbenäget än Taq-polymeras.
• Genererar stora fragment, över 10kb.
• Producerar mer DNA än PCR-baserade metoder, i ungefär en storleksordning.
• Kräver minimal mängd mall; 10 ng räcker.
• Ny replikeringsmekanism; flersträngsförskjutningsförstärkning.
  • Slumpmässiga primrar (hexamerer) kan användas, inget behov av att designa specifika primers/målspecifika regioner.
  • Inget behov av termisk cykling.
• Bra täckning och en minskad amplifieringsbias jämfört med PCR-baserade metoder. Det finns spekulationer om att det är den minst partiska av de WGA-metoder som används.

Vidare läsning

•   Linck L, Resch-Genger U (2010). "Identifiering av effektiva fluoroforer för direkt märkning av DNA via rullande cirkelamplifiering (RCA) polymeras φ29". Eur J Med Chem . 45 (12): 5561–6. doi : 10.1016/j.ejmech.2010.09.005 . PMID 20926164 .
•    de Vega M, Lázaro JM, Mencía M, Blanco L, Salas M (2010). "Förbättring av φ29 DNA-polymerasförstärkningsprestanda genom fusion av DNA-bindande motiv" . Proc Natl Acad Sci USA . 107 (38): 16506–11. Bibcode : 2010PNAS..10716506D . doi : 10.1073/pnas.1011428107 . PMC 2944734 . PMID 20823261 .
•   Pérez-Arnaiz P, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2010). "phi29 DNA-polymeras aktivt ställe: roll för rest Val250 som metall-dNTP-komplexligand och i proteinprimad initiering". J Mol Biol . 395 (2): 223–33. doi : 10.1016/j.jmb.2009.10.061 . PMID 19883660 .
•   Pérez-Arnaiz P, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2009). "Funktionell betydelse av bakteriofag phi29 DNA-polymerasrest Tyr148 i primer-terminus stabilisering vid 3'-5' exonukleas aktiva plats". J Mol Biol . 391 (5): 797–807. doi : 10.1016/j.jmb.2009.06.068 . PMID 19576228 .
•   Johne R, Müller H, Rector A, van Ranst M, Stevens H (2009). "Rullande cirkelamplifiering av virala DNA-genom med phi29-polymeras". Trender Microbiol . 17 (5): 205–11. doi : 10.1016/j.tim.2009.02.004 . PMID 19375325 .
•    Lagunavicius A, Merkiene E, Kiveryte Z, Savaneviciute A, Zimbaite-Ruskuliene V, Radzvilavicius T, Janulaitis A (2009). "Ny tillämpning av Phi29 DNA-polymeras: RNA-detektion och analys in vitro och in situ av mål-RNA-primad RCA" . RNA . 15 (5): 765–71. doi : 10.1261/rna.1279909 . PMC 2673074 . PMID 19244362 .
•    Rodríguez I, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2009). "Involvering av TPR2-subdomänrörelsen i aktiviteterna för phi29 DNA-polymeras" . Nucleic Acids Res . 37 (1): 193–203. doi : 10.1093/nar/gkn928 . PMC 2615600 . PMID 19033368 .
•    Sahu S, LaBean TH, Reif JH (2008). "En DNA-nanotransportanordning som drivs av polymeras phi29". Nano Lett . 8 (11): 3870–8. CiteSeerX 10.1.1.151.6316 . doi : 10.1021/nl802294d . PMID 18939810 .
•    Xu Y, Gao S, Bruno JF, Luft BJ, Dunn JJ (2008). "Snabb detektion och identifiering av en patogens DNA med Phi29 DNA-polymeras" . Biochem. Biophys. Res. Commun . 375 (4): 522–5. doi : 10.1016/j.bbrc.2008.08.082 . PMC 2900840 . PMID 18755142 .
•   Kumar G, Garnova E, Reagin M, Vidali A (2008). "Förbättrad multipelförskjutningsamplifiering med phi29 DNA-polymeras för genotypning av enstaka mänskliga celler" . Biotekniker . 44 (7): 879–90. doi : 10.2144/000112755 . PMID 18533898 .
•    Salas M, Blanco L, Lázaro JM, de Vega M (2008). "Bakteriofagen phi29 DNA-polymeras". IUBMB liv . 60 (1): 82–5. doi : 10.1002/iub.19 . PMID 18379997 . S2CID 39622915 .
•    Silander K, Saarela J (2008). Helgenomamplifiering med Phi29 DNA-polymeras för att möjliggöra genetisk eller genomisk analys av prover med lågt DNA-utbyte . Metoder i molekylärbiologi. Vol. 439. s. 1–18. doi : 10.1007/978-1-59745-188-8_1 . ISBN 978-1-58829-871-3 . PMID 18370092 .
•    Lagunavicius A, Kiveryte Z, Zimbaite-Ruskuliene V, Radzvilavicius T, Janulaitis A (2008). "Dualitet av polynukleotidsubstrat för Phi29 DNA-polymeras: 3'-->5' RNas-aktivitet hos enzymet" . RNA . 14 (3): 503–13. doi : 10.1261/rna.622108 . PMC 2248250 . PMID 18230765 .
•    Pérez-Arnaiz P, Longás E, Villar L, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2007). "Involvering av fag phi29 DNA-polymeras och terminala proteinsubdomäner för att ge specificitet under initiering av proteinprimad DNA-replikation" . Nucleic Acids Res . 35 (21): 7061–73. doi : 10.1093/nar/gkm749 . PMC 2175359 . PMID 17913744 .
•    Berman AJ, Kamtekar S, Goodman JL, Lázaro JM, de Vega M, Blanco L, Salas M, Steitz TA (2007). "Strukturer av phi29 DNA-polymeras komplexbundet med substrat: mekanismen för translokation i B-familjepolymeraser" . EMBO J . 26 (14): 3494–505. doi : 10.1038/sj.emboj.7601780 . PMC 1933411 . PMID 17611604 .
•    Knierim D, Maiss E (2007). "Tillämpning av Phi29 DNA-polymeras för identifiering och fullängds klonympning av tomatgul bladcurl Thailand-virus och tobaksbladcurl Thailand-virus". Arch Virol . 152 (5): 941–54. doi : 10.1007/s00705-006-0914-9 . PMID 17226067 . S2CID 12464800 .
•   Owor BE, Shepherd DN, Taylor NJ, Edema R, Monjane AL, Thomson JA, Martin DP, Varsani A (2007). "Framgångsrik tillämpning av FTA Classic Card-teknologi och användning av bakteriofag phi29 DNA-polymeras för storskalig fältprovtagning och kloning av kompletta majsstrimvirusgenom". J Virol Methods . 140 (1–2): 100–5. doi : 10.1016/j.jviromet.2006.11.004 . PMID 17174409 .
•   Sato M, Ohtsuka M, Ohmi Y (2004). "Repeterad GenomiPhi, phi29 DNA-polymerasbaserad rullande cirkelamplifiering, är användbar för generering av stora mängder plasmid-DNA. " Nukleinsyror Symp Ser (Oxf) . 48 (48): 147–8. doi : 10.1093/nass/48.1.147 . PMID 17150521 .
•    Pérez-Arnaiz P, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2006). "Involvering av phi29 DNA-polymeras tumsubdomän i korrekt koordinering av syntes och nedbrytning under DNA-replikation" . Nucleic Acids Res . 34 (10): 3107–15. doi : 10.1093/nar/gkl402 . PMC 1475753 . PMID 16757576 .
•    Kamtekar S, Berman AJ, Wang J, Lázaro JM, de Vega M, Blanco L, Salas M, Steitz TA (2006). "Phi29 DNA-polymeras:protein-primerstrukturen föreslår en modell för initiering till förlängningsövergång" . EMBO J . 25 (6): 1335–43. doi : 10.1038/sj.emboj.7601027 . PMC 1422159 . PMID 16511564 .
•    Hutchison CA, Smith HO, Pfannkoch C, Venter JC (2005). "Cellfri kloning med phi29 DNA-polymeras" . Proc Natl Acad Sci USA . 102 (48): 17332–6. Bibcode : 2005PNAS..10217332H . doi : 10.1073/pnas.0508809102 . PMC 1283157 . PMID 16286637 .
•   Sato M, Ohtsuka M, Ohmi Y (2005). "Användbarheten av upprepad GenomiPhi, ett phi29 DNA-polymerasbaserat rullande cirkelförstärkningskit, för generering av stora mängder plasmid-DNA". Biomol Eng . 22 (4): 129–32. doi : 10.1016/j.bioeng.2005.05.001 . PMID 16023891 .
•    Rodríguez I, Lázaro JM, Blanco L, Kamtekar S, Berman AJ, Wang J, Steitz TA, Salas M, de Vega M (2005). "En specifik subdomän i phi29 DNA-polymeras ger både processivitet och strängförskjutningskapacitet" . Proc Natl Acad Sci USA . 102 (18): 6407–12. Bibcode : 2005PNAS..102.6407R . doi : 10.1073/pnas.0500597102 . PMC 1088371 . PMID 15845765 .
•   Truniger V, Bonnin A, Lázaro JM, de Vega M, Salas M (2005). "Involvering av "linker"-regionen mellan exonukleas- och polymerisationsdomänerna av phi29 DNA-polymeras i DNA- och TP-bindning". Gene . 348 : 89–99. doi : 10.1016/j.gene.2004.12.041 . PMID 15777661 .
•   Umetani N, de Maat MF, Mori T, Takeuchi H, Hoon DS (2005). "Syntes av universellt ometylerat kontroll-DNA genom kapslad helgenomamplifiering med phi29 DNA-polymeras". Biochem. Biophys. Res. Commun . 329 (1): 219–23. doi : 10.1016/j.bbrc.2005.01.088 . PMID 15721296 .
•   Gadkar V, Rillig MC (2005). "Applicering av Phi29 DNA-polymerasmedierad helgenomamplifiering på enstaka sporer av arbuskulära mykorrhiza (AM) svampar" . FEMS Microbiol Lett . 242 (1): 65–71. doi : 10.1016/j.femsle.2004.10.041 . PMID 15621421 .
•   Kamtekar S, Berman AJ, Wang J, Lázaro JM, de Vega M, Blanco L, Salas M, Steitz TA (2004). "Insikter i strängförskjutning och processivitet från kristallstrukturen av det proteinprimerade DNA-polymeraset från bakteriofag phi29" . Mol Cell . 16 (4): 609–18. doi : 10.1016/j.molcel.2004.10.019 . PMID 15546620 .
•    Adachi E, Shimamura K, Wakamatsu S, Kodama H (2004). "Amplifiering av växtgenomiskt DNA med Phi29 DNA-polymeras för användning vid fysisk kartläggning av den hypermetylerade genomiska regionen". Plant Cell Rep . 23 (3): 144–7. doi : 10.1007/s00299-004-0806-y . PMID 15168072 . S2CID 11041367 .
•   Rodríguez I, Lázaro JM, Salas M, De Vega M (2004). "phi29 DNA-polymeras-terminal proteininteraktion. Involvering av rester specifikt konserverade bland proteinprimade DNA-polymeraser". J Mol Biol . 337 (4): 829–41. doi : 10.1016/j.jmb.2004.02.018 . PMID 15033354 .
•   Inoue-Nagata AK, Albuquerque LC, Rocha WB, Nagata T (2004). "En enkel metod för att klona hela begomovirusgenomet med hjälp av bakteriofagen phi29 DNA-polymeras". J Virol Methods . 116 (2): 209–11. doi : 10.1016/j.jviromet.2003.11.015 . PMID 14738990 .
•    Truniger V, Lázaro JM, Salas M (2004). "Funktion av C-terminalen av phi29 DNA-polymeras i DNA och terminal proteinbindning" . Nucleic Acids Res . 32 (1): 361–70. doi : 10.1093/nar/gkh184 . PMC 373294 . PMID 14729920 .
•   Truniger V, Lázaro JM, Salas M (2004). "Två positivt laddade rester av phi29 DNA-polymeras, konserverade i proteinprimade DNA-polymeraser, är involverade i stabiliseringen av den inkommande nukleotiden". J Mol Biol . 335 (2): 481–94. doi : 10.1016/j.jmb.2003.10.024 . PMID 14672657 .
•   Rodríguez I, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2003). "phi29 DNA-polymerasrest Phe128 av det mycket konserverade (S/T)Lx(2)h-motivet krävs för en stabil och funktionell interaktion med det terminala proteinet". J Mol Biol . 325 (1): 85–97. doi : 10.1016/S0022-2836(02)01130-0 . PMID 12473453 .
•   Nelson JR, Cai YC, Giesler TL, Farchaus JW, Sundaram ST, Ortiz-Rivera M, Hosta LP, Hewitt PL, Mamone JA, Palaniappan C, Fuller CW (2002). "TempliPhi, phi29 DNA-polymerasbaserad rullande cirkelamplifiering av mallar för DNA-sekvensering". Biotekniker . Suppl: 44–7. PMID 12083397 .
•   Truniger V, Lázaro JM, Blanco L, Salas M (2002). "En starkt konserverad lysinrest i phi29 DNA-polymeras är viktig för korrekt bindning av den schablonmässiga nukleotiden under initiering av phi29 DNA-replikation". J Mol Biol . 318 (1): 83–96. doi : 10.1016/S0022-2836(02)00022-0 . PMID 12054770 .
•    Truniger V, Lázaro JM, Esteban FJ, Blanco L, Salas M (2002). "En positivt laddad rest av phi29 DNA-polymeras, starkt konserverad i DNA-polymeraser från familjerna A och B, är involverad i att binda den inkommande nukleotiden" . Nucleic Acids Res . 30 (7): 1483–92. doi : 10.1093/nar/30.7.1483 . PMC 101840 . PMID 11917008 .
•    Eisenbrandt R, Lázaro JM, Salas M, de Vega M (2002). "Phi29 DNA-polymerasrester Tyr59, His61 och Phe69 av det mycket konserverade ExoII-motivet är väsentliga för interaktion med det terminala proteinet" . Nucleic Acids Res . 30 (6): 1379–86. doi : 10.1093/nar/30.6.1379 . PMC 101362 . PMID 11884636 .
•    Elías-Arnanz M, Salas M (1999). "Upplösning av frontalkollisioner mellan transkriptionsmaskineriet och bakteriofag phi29 DNA-polymeras är beroende av RNA-polymerastranslokation. " EMBO J . 18 (20): 5675–82. doi : 10.1093/emboj/18.20.5675 . PMC 1171634 . PMID 10523310 .
•   de Vega M, Blanco L, Salas M (1999). "Processiv korrekturläsning och det rumsliga förhållandet mellan polymeras och exonukleas aktiva platser för bakteriofag phi29 DNA-polymeras". J Mol Biol . 292 (1): 39–51. doi : 10.1006/jmbi.1999.3052 . PMID 10493855 .
•   Bonnin A, Lázaro JM, Blanco L, Salas M (1999). "En enda tyrosin förhindrar införande av ribonukleotider i phi29-DNA-polymeraset av eukaryotisk typ". J Mol Biol . 290 (1): 241–51. doi : 10.1006/jmbi.1999.2900 . PMID 10388570 .
•   Truniger V, Blanco L, Salas M (1999). "Roll för "YxGG/A"-motivet av Phi29 DNA-polymeras i proteinprimad replikation". J Mol Biol . 286 (1): 57–69. doi : 10.1006/jmbi.1998.2477 . PMID 9931249 .
•   de Vega M, Blanco L, Salas M (1998). "phi29 DNA-polymerasrest Ser122, en enkelsträngad DNA-ligand för 3'-5' exonukleolys, krävs för att interagera med det terminala proteinet" . J Biol Chem . 273 (44): 28966–77. doi : 10.1074/jbc.273.44.28966 . PMID 9786901 .
•   Saturno J, Lázaro JM, Blanco L, Salas M (1998). "Roll för den första aspartatresten av "YxDTDS"-motivet av phi29 DNA-polymeras som en metallligand under både TP-primad och DNA-primad DNA-syntes". J Mol Biol . 283 (3): 633–42. doi : 10.1006/jmbi.1998.2121 . PMID 9784372 .
•   Murthy V, Meijer WJ, Blanco L, Salas M (1998). "DNA-polymerasmallbyte på specifika platser på phi29-genomet orsakar in vivo-ackumulering av subgenomiska phi29-DNA-molekyler" . Mol Microbiol . 29 (3): 787–98. doi : 10.1046/j.1365-2958.1998.00972.x . PMID 9723918 .
•   Illana B, Zaballos A, Blanco L, Salas M (1998). "RGD-sekvensen i fag phi29-terminalt protein krävs för interaktion med phi29 DNA-polymeras" . Virologi . 248 (1): 12–9. doi : 10.1006/viro.1998.9276 . PMID 9705251 .
•   de Vega M, Lázaro JM, Salas M, Blanco L (1998). "Mutationsanalys av phi29 DNA-polymerasrester som fungerar som ssDNA-ligander för 3'-5' exonukleolys". J Mol Biol . 279 (4): 807–22. doi : 10.1006/jmbi.1998.1805 . PMID 9642062 .
•   Blanco L, Salas M (1996). "Relaterar struktur till funktion i phi29 DNA-polymeras" . J Biol Chem . 271 (15): 8509–12. doi : 10.1074/jbc.271.15.8509 . PMID 8621470 .
•    de Vega M, Lazaro JM, Salas M, Blanco L (1996). "Primer-terminus stabilisering vid 3'-5' exonukleas aktiva ställe av phi29 DNA polymeras. Involvering av två aminosyrarester mycket konserverade i korrekturläsning av DNA polymeraser" . EMBO J . 15 (5): 1182–92. doi : 10.1002/j.1460-2075.1996.tb00457.x . PMC 450017 . PMID 8605889 .