Xenopus äggextrakt

Xenopus äggextrakt är ett lysat som framställs genom att krossa äggen från den afrikanska klogrodan Xenopus laevis . Det erbjuder ett kraftfullt cellfritt (eller in vitro ) system för att studera olika cellbiologiska processer, inklusive cellcykelprogression , kärntransport , DNA-replikation och kromosomsegregation . Det kallas också Xenopus äggcellsfritt system eller Xenopus äggcellsfritt extrakt.

Historia

Det första grodäggsextraktet rapporterades 1983 av Lohka och Masui. Detta banbrytande arbete använde ägg från den nordliga leopardgrodan Rana pipiens för att förbereda ett extrakt. Senare tillämpades samma procedur på ägg av Xenopus laevis , vilket blev populärt för att studera cellcykelprogression och cellcykelberoende cellulära händelser. Extrakt härrörande från ägg från den japanska paddan Bufo japonicus eller från den västerländska klösgrodan Xenopus tropicalis har också rapporterats.

Grunderna för extraktberedning

Cellcykeln för obefruktade ägg av X. laevis stoppas högst synkront vid metafas av meios II . Vid befruktning frisätts metafasstoppet genom verkan av Ca ²⁺ -joner som frigörs från det endoplasmatiska retikulumet , vilket initierar tidiga embryonala cellcykler som alternerar S-fas ( DNA-replikation ) och M-fas ( mitos ).

M-fasextrakt

Figur 1. Ett äggextrakt framställs genom att krossa X. laevis -ägg genom centrifugering

Obefruktade ägg i en buffert innehållande Ca2+ -kelatorn EGTA (etylenglykoltetraättiksyra) packas i ett centrifugrör. Efter att ha tagit bort överskottsbuffert krossas äggen genom centrifugering (~10 000 g). En löslig fraktion som uppträder mellan lipidlocket och äggulan kallas ett M-fasextrakt. Detta extrakt innehåller en hög nivå av cyklin B - Cdk1 . När demembranerade spermiekärnor inkuberas med detta extrakt, genomgår det en serie strukturella förändringar och omvandlas så småningom till en uppsättning M-fas kromosomer med bipolära spindlar .

Interfas (S-fas) extrakt

Olika typer av äggextrakt

Cykelextrakt

Figur 2. En interfaskärna (vänster) och ett kluster av mitotiska kromosomer (höger) producerade i ett cyklande extrakt. Stång, 10 µm.

Höghastighetssupernatant (HSS)

Nukleoplasmatiskt extrakt (NPE)

Upptäckter gjorda med hjälp av äggextrakt

Rening av M-fas-främjande faktor (MPF)
Belysande av rollen för syntes och nedbrytning av cyklin B i cellcykelprogression
Upptäckten att nedbrytning av ett eller flera andra proteiner än cyklin B är nödvändig för att initiera kromosomsegregering
Upptäckt av en mekanism för spindelsammansättning som beror på kromatin , men inte centrosomer
Förslag till ett licensieringssystem för DNA-replikering och identifiering av dess ansvariga faktor
Identifiering av importin α/β ansvarig för nukleär transport
Upptäckt av kondensinkomplexet som är väsentligt för sammansättning av mitotiska kromosomer
Identifiering av kohesinkomplexet väsentligt för systerkromatidkohesion

På senare tid har äggextrakten använts för att studera omprogrammering av differentierade kärnor, fysiska egenskaper hos spindlar och kärnor och teoretisk förståelse av cellcykelkontroll.

Se även