Spatiotemporalt genuttryck

Genuttrycksmönster regleras både spatialt och temporärt i embryon av Drosophila melanogaster .

Spatiotemporal genuttryck är aktiveringen av gener i specifika vävnader i en organism vid specifika tidpunkter under utvecklingen . Genaktiveringsmönster varierar mycket i komplexitet. Vissa är enkla och statiska, som tubulins mönster, som uttrycks i alla celler vid alla tidpunkter i livet. Vissa, å andra sidan, är utomordentligt invecklade och svåra att förutsäga och modellera, med uttryck som fluktuerar vilt från minut till minut eller från cell till cell. Spatiotemporal variation spelar en nyckelroll för att generera mångfalden av celltyper som finns i utvecklade organismer; eftersom identiteten för en cell specificeras av samlingen av gener som aktivt uttrycks inom den cellen, om genuttrycket var enhetligt spatialt och tidsmässigt, skulle det kunna finnas högst en sorts cell.

Betrakta genen wingless, en medlem av wnt -familjen av gener. I den tidiga embryonala utvecklingen av modellorganismen Drosophila melanogaster , eller fruktfluga, uttrycks vinglös över nästan hela embryot i alternerande ränder med tre celler separerade. Detta mönster går förlorat när organismen utvecklas till en larv, men vinglöst uttrycks fortfarande i en mängd olika vävnader som vingskivorna, vävnadsfläckar som kommer att utvecklas till de vuxna vingarna. Det spatiotemporala mönstret av vinglöst genuttryck bestäms av ett nätverk av regulatoriska interaktioner som består av effekterna av många olika gener såsom even-skipped och Krüppel.

Vad orsakar rumsliga och tidsmässiga skillnader i uttrycket av en enskild gen? Eftersom nuvarande uttrycksmönster är strikt beroende av tidigare uttrycksmönster, finns det ett regressivt problem med att förklara vad som orsakade de första skillnaderna i genuttryck. Processen genom vilken enhetligt genuttryck blir rumsligt och tidsmässigt differentiellt kallas symmetribrytning . Till exempel, i fallet med embryonal Drosophila- utveckling, uttrycks generna nanos och bicoid asymmetriskt i oocyten eftersom moderns celler deponerar budbärar-RNA (mRNA) för dessa gener i äggets poler innan det läggs .

Den gammakristallina promotorn driver uttrycket av den grönt fluorescerande proteinreportergenen uteslutande i ögat på en vuxen groda.

Identifiera spatiotemporala mönster

Ett sätt att identifiera uttrycksmönstret för en viss gen är att placera en reportergen nedströms om dess promotor. I denna konfiguration kommer promotorgenen att orsaka att reportergenen uttrycks endast där och när genen av intresse uttrycks. Expressionsfördelningen av reportergenen kan bestämmas genom att visualisera den. Till exempel kan reportergenen grönt fluorescerande protein visualiseras genom att stimulera det med blått ljus och sedan använda en digitalkamera för att registrera grön fluorescerande emission.

Om promotorn för genen av intresse är okänd, finns det flera sätt att identifiera dess spatiotemporala fördelning. Immunhistokemi involverar framställning av en antikropp med specifik affinitet för proteinet associerat med genen av intresse. Denna fördelning av denna antikropp kan sedan visualiseras med en teknik såsom fluorescerande märkning. Immunhistokemi har fördelarna av att vara metodologiskt genomförbar och relativt billig. Dess nackdelar inkluderar icke-specificitet hos antikroppen som leder till falsk positiv identifiering av uttryck. Dålig penetrering av antikroppen i målvävnaden kan leda till falskt negativa resultat. Dessutom, eftersom immunhistokemi visualiserar proteinet som genereras av genen, om proteinprodukten diffunderar mellan celler, eller har en särskilt kort eller lång halveringstid i förhållande till det mRNA som används för att översätta proteinet, kan detta leda till en förvrängd tolkning av vilken celler uttrycker mRNA .

In situ hybridiseringar av gener uttryckta i artärer (överst) och vener (nederst) i zebrafisk. Blå färgning indikerar närvaro av genens mRNA. Paneler till vänster är normala djur, medan djur till höger är muterade i Notch-genen. Fisk som saknar Notch har färre artärer och fler vener vid denna tidpunkt i utvecklingstiden.

Hybridisering in situ är en alternativ metod där en "sond", en syntetisk nukleinsyra med en sekvens som är komplementär till genens mRNA, tillsätts till vävnaden. Denna sond är sedan kemiskt märkt så att den kan visualiseras senare. Denna teknik möjliggör visualisering specifikt av mRNA-producerande celler utan några av de artefakter som är associerade med immunhistokemi. Det är dock notoriskt svårt och kräver kunskap om sekvensen av DNA som motsvarar genen av intresse.

En metod som kallas enhancer-trap screening avslöjar mångfalden av spatiotemporala genuttrycksmönster som är möjliga i en organism. I denna teknik sätts DNA som kodar för en reportergen slumpmässigt in i genomet. Beroende på genpromotorerna proximalt till insättningspunkten kommer reportergenen att uttryckas i speciella vävnader vid särskilda punkter i utvecklingen. Även om uttrycksmönster härledda från förstärkarfällan inte nödvändigtvis återspeglar de faktiska uttrycksmönstren för specifika gener, avslöjar de mångfalden av spatiotemporala mönster som är tillgängliga för evolution.

Reportergener kan visualiseras i levande organismer, men både immunhistokemi och in situ hybridisering måste utföras i fixerade vävnader. Tekniker som kräver fixering av vävnad kan bara generera en enda tidsmässig tidpunkt per enskild organism. Men att använda levande djur istället för fixerad vävnad kan vara avgörande för att dynamiskt förstå uttrycksmönster under en individs livslängd. Hur som helst kan variation mellan individer förvirra tolkningen av tidsmässiga uttrycksmönster.

Metoder för att kontrollera spatiotemporal genuttryck

Flera metoder eftersträvas för att kontrollera genuttryck spatialt, temporärt och i olika grader. En metod är att använda operoninducerare /repressorsystem som tillhandahåller tidskontroll av genuttryck. För att kontrollera genuttryck rumsligt är bläckstråleskrivare under utveckling för utskrift av ligander på gelkultur. En annan populär metod involverar användning av ljus för att kontrollera genuttryck på spatiotemporalt sätt. Eftersom ljus även lätt kan kontrolleras i rum, tid och grad, har flera metoder för att kontrollera genuttryck på DNA- och RNA-nivå utvecklats och studeras. Till exempel kan RNA-interferens kontrolleras med hjälp av ljus och även mönstring av genuttryck har utförts i cellmonolager och i zebrafiskembryon med användning av burad morfolino eller peptidnukleinsyra som visar kontrollen av genuttryck spatiotemporalt. Nyligen har ljusbaserad kontroll visats på DNA-nivå med användning av transgenbaserat system eller triplexbildande oligo i bur

externa länkar