Sekretomik

Sekretomik är en typ av proteomik som involverar analys av sekretomet - alla utsöndrade proteiner i en cell, vävnad eller organism. Utsöndrade proteiner är involverade i en mängd olika fysiologiska processer, inklusive cellsignalering och matrixremodellering , men är också integrerade i invasion och metastasering av maligna celler . Sekretomik har därför varit särskilt viktig i upptäckten av biomarkörer för cancer och förståelse av molekylär grund för patogenes. Analysen av den olösliga fraktionen av sekretomet (den extracellulära matrisen ) har benämnts matrisomics.

Sekretomets historia

År 2000 Tjalsma et al. myntade termen "sekretom" i sin studie av eubacterium B. subtilis . De definierade sekretomet som alla utsöndrade proteiner och sekretionsmaskineri av bakterierna. Med hjälp av en databas med proteinsekvenser i B. subtilis och en algoritm som tittade på klyvningsställen och aminoterminala signalpeptider som är karakteristiska för utsöndrade proteiner kunde de förutsäga vilken del av proteomet som utsöndras av cellen. År 2001 satte samma labb en standard för sekretomik – förutsägelser baserade på enbart aminosyrasekvens räcker inte för att definiera sekretomet. De använde tvådimensionell gelelektrofores och masspektrometri för att identifiera 82 proteiner som utsöndras av B. subtilis , av vilka endast 48 hade förutspåtts med användning av den genombaserade metoden i deras tidigare artikel. Detta visar behovet av proteinverifiering av förutsagda fynd.

När den komplicerade karaktären hos sekretoriska vägar avslöjades – nämligen att det finns många icke-klassiska sekretionsvägar och det finns många icke-utsöndrade proteiner som är en del av den klassiska sekretoriska vägen – blev en mer djupgående definition av sekretomet nödvändig . År 2010, Agrawal et al. föreslog att definiera sekretomet som "den globala gruppen av utsöndrade proteiner i det extracellulära utrymmet av en cell, vävnad, organ eller organism vid varje given tidpunkt och villkor genom kända och okända sekretoriska mekanismer som involverar konstitutiva och reglerade sekretoriska organeller".

Utmaningar med sekretomisk analys

Föroreningar

I odling är celler omgivna av föroreningar. Bovint serum från cellodlingsmedia och cellrester kan kontaminera samlingen av utsöndrade proteiner som används för analys. Bovina kontaminanter utgör en speciell utmaning eftersom proteinsekvenserna för många extracellulära proteiner från nötkreatur, såsom fibronektin och fibulin-1 , liknar de humana proteinsekvenserna. För att avlägsna dessa föroreningar kan celler tvättas med PBS eller serumfritt medium (SFM) innan de inkuberas i SFM och samlar upp utsöndrade proteiner. Försiktighet måste iakttas så att inte celler spricker, vilket frigör intracellulära proteiner. Dessutom måste inkubationstid och -förhållanden optimeras så att den metaboliska stress som kan induceras av bristen på näringsämnen i SFM inte påverkar sekretomisk analys.

Låg koncentration

Vissa proteiner utsöndras i låg mängd och späds sedan ut ytterligare i cellodlingsmediet eller kroppsvätskan, vilket gör dessa proteiner svåra att upptäcka och analysera. Koncentrationsmetoder som TCA-utfällning kan användas såväl som mycket känsliga metoder som antikroppsmikroarrayer som kan detektera även enstaka molekyler av ett protein.

Relevans av in vitro -studier

Många sekretomiska studier utförs in vitro med cellodlingsmetoder, men det är oklart om samma proteiner utsöndras in vivo . Fler och fler studier, särskilt de som tittar på cancersekretomet, använder in vivo- metoder för att bekräfta relevansen av de resultat som erhållits in vitro . Till exempel kan proximala biologiska vätskor samlas in i anslutning till en tumör för att utföra en sekretomisk analys.

Metoder

Genomomfattande förutsägelse

Många utsöndrade proteiner har en N-terminal peptidsekvens som signalerar för det translaterade proteinet att flytta in i det endoplasmatiska retikulumet där bearbetningen sker som i slutändan kommer att leda till utsöndring. Närvaron av dessa signalpeptider kan användas för att förutsäga en cells sekretom. Vissa sekretoriska proteiner har inte klassiska signalpeptidsekvenser. Dessa kallas "ledarelösa sekretoriska proteiner" (LSP).

Genomomfattande prediktionsmetoder har en mängd olika problem. Det finns en stor risk för falska positiva och falska negativa. Dessutom påverkas genuttryck kraftigt av miljöförhållanden, vilket betyder att ett sekretom som förutsägs från genomet eller ett cDNA- bibliotek sannolikt inte kommer att matcha helt med det sanna sekretomet. Proteomiska tillvägagångssätt är nödvändiga för att validera alla förutsagda utsöndrade proteiner.

Flera genomomfattande sekretomdatabaser eller kunskapsbaser är tillgängliga baserat på både kuration och beräkningsförutsägelse. Dessa databaser inkluderar svampsekretomdatabasen (FSD), svampsekretomens kunskapsbas (FunSecKB) och mjölksyrabakteriesekretomdatabasen. Den humana och animaliska subcellulära lokaliseringsdatabasen för humant och animaliskt protein ( MetaSecKB ) och den protista subcellulära proteomdatabasen ( ProtSecKB ) har också nyligen släppts. Även om det finns vissa felaktigheter i beräkningsförutsägelsen, tillhandahåller dessa databaser användbara resurser för att ytterligare karakterisera proteinets subcellulära platser.

Proteomiska tillvägagångssätt

Masspektrometrianalys är en integrerad del av sekretomik. Serum eller supernatant innehållande utsöndrade proteiner digereras med ett proteas och proteinerna separeras med 2D-gelelektrofores eller kromatografiska metoder. Varje enskilt protein analyseras sedan med masspektrometri och det peptidmassfingeravtrycket kan köras genom en databas för att identifiera proteinet.

Stabil isotopmärkning av aminosyror i cellkultur (SILAC) har dykt upp som en viktig metod inom sekretomik – den hjälper till att skilja mellan utsöndrade proteiner och nötkreatursserumföroreningar i cellkultur. Supernatant från celler odlade i normalt medium och celler odlade i medium med stabilisotopmärkta aminosyror blandas i ett 1:1-förhållande och analyseras med masspektrometri. Proteinföroreningar i serumet visar bara en topp eftersom de inte har en märkt motsvarighet. Som ett exempel har SILAC-metoden använts framgångsrikt för att skilja mellan proteiner som utsöndras av mänskliga kondrocyter i kultur och serumföroreningar.

En antikroppsmikroarray är en mycket känslig och hög genomströmningsmetod för proteindetektion som nyligen har blivit en del av sekretomisk analys. Antikroppar , eller annan typ av bindemedelsmolekyl, fixeras på ett fast underlag och en fluorescensmärkt proteinblandning tillsätts. Signalintensiteter används för att identifiera proteiner. Antikroppsmikroarrayer är extremt mångsidiga – de kan användas för att analysera mängden protein i en blandning, olika proteinisoformer , posttranslationella modifieringar och proteiners biokemiska aktivitet. Dessutom är dessa mikroarrayer mycket känsliga – de kan detektera enstaka proteinmolekyler. Antikroppsmikroarrayer används för närvarande mest för att analysera humana plasmaprover men kan också användas för odlade celler och kroppsvätskesekretomik, vilket ger ett enkelt sätt att leta efter förekomsten av många proteiner samtidigt.

Implikationer och betydelse

Upptäckt av cancerbiomarkörer

Förutom att vara viktiga i normala fysiologiska processer har utsöndrade proteiner också en integrerad roll i tumörbildning genom celltillväxt, migration, invasion och angiogenes , vilket gör sekretomik till en utmärkt metod för upptäckt av cancerbiomarkörer. Det kan vara extremt svårt att använda en kroppsvätska eller full serumproteomisk metod för att identifiera biomarkörer – kroppsvätskor är komplexa och mycket varierande. Sekretomisk analys av cancercellinjer eller sjuk vävnad utgör ett enklare och mer specifikt alternativ för upptäckt av biomarkörer.

De två huvudsakliga biologiska källorna för cancersekretomik är supernatanter av cancercellinjer och proximala biologiska vätskor, vätskorna i kontakt med en tumör . Cancercellinjesupernatanten är en attraktiv källa för utsöndrade proteiner. Det finns många standardiserade cellinjer tillgängliga och supernatanten är mycket enklare att analysera än proximal kroppsvätska. Men det är oklart om ett cellinjesekretom är en bra representation av en verklig tumör i dess specifika mikromiljö och en standardiserad cellinje är inte illustrativ för heterogeniteten hos en verklig tumör. Analys av proximala vätskor kan ge en bättre uppfattning om ett mänskligt tumörsekretom, men denna metod har också sina nackdelar. Procedurerna för att samla in proximala vätskor behöver fortfarande standardiseras och icke-maligna kontroller behövs. Dessutom kan miljömässiga och genetiska skillnader mellan patienter försvåra analysen.

Sekretomisk analys har upptäckt potentiella nya biomarkörer i många cancertyper, inklusive lungcancer , levercancer , pankreascancer , kolorektal cancer , prostatacancer och bröstcancer . Prostataspecifikt antigen (PSA), den nuvarande standardbiomarkören för prostatacancer, har en låg diagnostisk specificitet – PSA-nivåer kan inte alltid skilja mellan aggressiv och icke-aggressiv cancer – och därför behövs en bättre biomarkör. Med hjälp av sekretomisk analys av prostatacellinjer kunde en studie upptäcka flera proteiner som finns i högre nivåer i serum hos cancerpatienter än hos friska kontroller.

Det finns också ett stort behov av biomarkörer för att upptäcka bröstcancer – för närvarande finns biomarkörer endast för att övervaka senare stadier av cancer. Sekretomisk analys av bröstcancercellinjer ledde till upptäckten av proteinet ALCAM som en ny biomarkör med lovande diagnostisk potential.

Assisterad reproduktionsteknologi

Att analysera det mänskliga embryonala sekretomet kan vara till hjälp för att hitta en icke-invasiv metod för att bestämma embryonens livskraft . Vid IVF bedöms embryon på morfologiska kriterier i ett försök att hitta de med hög implantationspotential . Att hitta en mer kvantitativ bedömningsmetod kan bidra till att minska antalet embryon som används vid IVF och därigenom minska graviditeter av högre ordning . Till exempel kunde en studie utveckla sekretomfingeravtryck för många blastocyster och fann 9 proteiner som kunde skilja mellan blastocyster med normalt och onormalt antal kromosomer . Denna typ av analys kan hjälpa till att ersätta preimplantation genetisk screening (PGS), som involverar biopsi av embryonala celler och kan vara skadligt för utvecklingen.