Rumslig transkriptomik
Spatial transcriptomics är en metod för att tilldela celltyper (identifierade av mRNA-avläsningarna) till deras platser i de histologiska sektionerna. Denna metod kan också användas för att bestämma subcellulär lokalisering av mRNA-molekyler. Termen är en variant av Spatial Genomics , som först beskrevs av Doyle, et al., 2000 och sedan utökades av Ståhl et al. i en teknik utvecklad 2016, som sedan dess har genomgått en mängd förbättringar och modifieringar.
Ståhl-metoden innebär att individuella vävnadsprover placeras på arrayerna av rumsligt streckkodade omvänd transkriptionsprimrar som kan fånga mRNA med oligo(dT)-svansarna. Förutom oligo(dT)-svans och rumslig streckkod, som indikerar x- och y-positionen på det arrayade objektglaset, innehåller sonden ett klyvningsställe, amplifierings- och sekvenseringshandtag och unik molekylär identifierare . Vanligtvis skärs histologiska prover med hjälp av kryotom , fixeras sedan, färgas och sätts på mikroarrayerna. Efter det genomgår den enzymatisk permeabilisering, så att molekyler kan diffundera ner till objektglaset, med ytterligare mRNA-frisättning och bindning till proberna. Omvänd transkription utförs sedan in situ . Som ett resultat syntetiseras rumsligt markerat komplementärt DNA, vilket ger information om genuttryck på den exakta platsen för provet. Således kombinerar beskrivna protokoll parallell sekvensering och färgning av samma prov. Det är viktigt att nämna att den första generationen av de arrangerade diabilderna bestod av cirka 1 000 fläckar med 100 μm diameter, vilket begränsar upplösningen till ~ 10-40 celler per plats.
I den bredare betydelsen av denna term inkluderar rumslig transkriptomik metoder som kan delas in i fem huvudsakliga tillvägagångssätt för att lösa rumslig distribution av transkript. De är mikrodissektionstekniker, fluorescerande in situ hybridiseringsmetoder, in situ sekvensering, in situ fångstprotokoll och in silico- metoder.
Ansökan
Att definiera den rumsliga fördelningen av mRNA-molekyler gör det möjligt för experimentalisten att avslöja cellulär heterogenitet i vävnader, tumörer, immunceller samt bestämma den subcellulära distributionen av transkript under olika förhållanden. Denna information ger en unik möjlighet att dechiffrera både den cellulära och subcellulära arkitekturen i både vävnader och enskilda celler. Dessa metoder ger avgörande insikter inom områdena embryologi, onkologi, immunologi och histologi. Funktionen hos de enskilda cellerna i flercelliga organismer kan endast förklaras fullständigt i samband med att identifiera deras exakta plats i kroppen. Spatial transcriptomics-tekniker försökte belysa cellers egenskaper på detta sätt. Nedan tittar vi på metoderna som kopplar genuttryck till den rumsliga organisationen av celler.
Mikrodissektion
Mikrodissektion med laserinfångning
Mikrodissektion med laserinfångning gör det möjligt att fånga enstaka celler utan att orsaka morfologiska förändringar. Den utnyttjar genomskinlig etylenvinylacetatfilm som är placerad på den histologiska sektionen och en infraröd laserstråle med låg effekt. När en sådan stråle är riktad mot cellerna av intresse, smälter filmen direkt ovanför målområdet tillfälligt så att dess långkedjiga polymerer täcker och tätt fångar cellerna. Sedan tas sektionen bort och celler av intresse förblir inbäddade i filmen. Denna metod tillåter ytterligare RNA-transkriptprofilering och cDNA-biblioteksgenerering av de hämtade cellerna.
RNA-sekvensering av individuella kryosnitt
RNA-sekvensering av de utvalda regionerna i individuella kryosnitt är en annan metod som kan producera platsbaserade genomomfattande uttrycksdata. Denna metod utförs utan laserinfångningsmikrodissektion. Det användes först för att bestämma genomomfattande rumsliga mönster av genuttryck i kryoskivade Drosophila-embryon. I huvudsak innebär det enkel förberedelse av biblioteket från de utvalda regionerna i provet. Denna metod hade svårigheter med att erhålla högkvalitativa RNA-seq-bibliotek från varje sektion på grund av materialförlusten som ett resultat av den lilla mängden totalt RNA i varje skiva. Detta problem löstes genom att tillsätta RNA från en avlägset besläktad Drosophila-art till varje rör efter initial RNA-extraktion.
TIVA
T ranskriptom in v ivo a nalysis (TIVA) är en teknik som möjliggör infångning av mRNA i levande enstaka celler i intakta levande vävnadssnitt . Den använder en fotoaktiverbar tagg. TIVA-taggen har flera funktionella grupper och en infångad poly(U)-oligonukleotid kopplad till biotin. En disulfidkopplad peptid, som ligger intill taggen, gör att den kan penetrera cellmembranet. Väl inuti används laserfotoaktivering för att avblockera poly(U)-oligonukleotid i cellerna av intresse, så att TIVA-taggen hybridiserar till mRNA i cellen. Därefter används streptavidinfångning av biotingruppen för att extrahera poly(A)-svansade mRNA-molekyler bundna till oblockerade taggar, varefter dessa mRNA analyseras genom RNA-sekvensering. Denna metod begränsas av låg genomströmning, eftersom endast ett fåtal enstaka celler kan bearbetas åt gången.
tomo-seq
Ett avancerat alternativ för RNA-sekvensering av individuella kryosektioner som beskrivs ovan, RNA-tomografi (tomo-seq) har bättre RNA-kvantifiering och rumslig upplösning. Den är också baserad på vävnadskryosektion med ytterligare RNA-sekvensering av enskilda sektioner, vilket ger genomomfattande uttrycksdata och bevarar rumslig information. I detta protokoll utelämnas användning av bärar-RNA på grund av linjär amplifiering av cDNA i individuella histologiska sektioner. Det identiska provet sektioneras i olika riktningar följt av 3D-transkriptionskonstruktion med överlappande data. Sammantaget innebär denna metod att man använder identiska prover för varje sektion och kan därför inte användas för bearbetning av kliniskt material.
LCM-seq
LCM-seq använder laser capture microdissection (LCM) i kombination med Smart-Seq2 RNA-sekvensering och är tillämpbar ner till encellsnivå och kan till och med användas på delvis nedbrutna vävnader. Arbetsflödet inkluderar kryosektion av vävnader följt av laserinfångningsmikrodissektion, där cellerna samlas in direkt i lyseringsbuffert och cDNA genereras utan behov av RNA-isolering, vilket både förenklar de experimentella procedurerna och sänker tekniskt brus. Eftersom den positionella identiteten för varje cell registreras under LCM-proceduren, kan transkriptomen för varje cell efter RNA-sekvensering av motsvarande cDNA-bibliotek härledas till positionen där den isolerades från. LCM-seq har applicerats på flera celltyper för att förstå deras inneboende egenskaper, inklusive oculomotoriska neuroner, ansiktsmotorneuroner, hypoglossala motorneuroner, spinala motorneuroner, röda nucleus neuroner, interneuroner, dopaminneuroner och kondrocyter.
Geo-seq
Geo-seq är en metod som använder både laserinfångningsmikrodissektion och encellig RNA-sekvensering för att bestämma den rumsliga fördelningen av transkriptomet i vävnadsområden som är cirka tio celler i storlek. Arbetsflödet involverar borttagning och kryosektion av vävnad följt av mikrodissektion med laserinfångning. Den extraherade vävnaden lyseras sedan och RNA:t renas och omvänt transkriberas till ett cDNA-bibliotek. Biblioteket sekvenseras och den transkriptomiska profilen kan mappas till den ursprungliga platsen för den extraherade vävnaden. Denna teknik tillåter användaren att definiera områden av intresse i en vävnad, extrahera nämnda vävnad och kartlägga transkriptomet i ett målinriktat tillvägagångssätt.
NICHE-seq
NICHE-seq-metoden använder fotoaktiverbara fluorescerande markörer och tvåfotonlaserskanningsmikroskopi för att tillhandahålla rumsliga data till det genererade transkriptomet. Cellerna bundna av den fluorescerande markören fotoaktiveras, dissocieras och sorteras via fluorescensaktiverad cellsortering. Detta ger sorteringsspecificitet till endast märkta, fotoaktiverade celler. Efter sortering genererar encellig RNA-sekvensering transkriptomet av de visualiserade cellerna. Denna metod kan bearbeta tusentals celler inom en definierad nisch till priset av att förlora rumslig data mellan celler i nischen.
ProximID
ProximID är en metod baserad på iterativ mikronedbrytning av extraherad vävnad till enstaka celler. Inledande milda matsmältningssteg bevarar små interagerande strukturer som registreras före fortsatt matsmältning. De enskilda cellerna separeras sedan från varje struktur och genomgår sc-RNAseq och grupperas med användning av t-fördelad stokastisk granninbäddning. De klustrade cellerna kan kartläggas till fysiska interaktioner baserat på de interagerande strukturerna före mikronedbrytningarna. Även om genomströmningen av denna teknik är relativt låg ger den information om fysisk interaktion mellan celler till datasetet.
Fluorescerande in situ hybridisering
NanoString CosMx
CosMx Spatial Molecular Imager är den första high-plex in situ analysplattformen som tillhandahåller rumslig multiomics med formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) och färskfrysta (FF) vävnadsprover i cellulär och subcellulär upplösning. Den möjliggör snabb kvantifiering och visualisering av upp till 1 000 RNA och 64 validerade proteinanalyter och är den flexibla, rumsliga encellsavbildningsplattformen för cellatlasering, vävnadsfenotypning, cell-cell-interaktioner, cellulära processer och biomarkörupptäckt.
smFISH
En av de första teknikerna som kunde uppnå rumsligt upplöst RNA-profilering av individuella celler var s s itu h ingle - molecule fluorescent in ybridization (smFISH) . Den implementerade korta (50 baspar) oligonukleotidsonder konjugerade med 5 fluoroforer som kunde binda till ett specifikt transkript och ge ljusa fläckar i provet. Detektering av dessa fläckar ger kvantitativ information om uttryck av vissa gener i cellen. Användningen av prober märkta med flera fluoroforer utmanades emellertid av självsläckande, förändrade hybridiseringsegenskaper, deras syntes och rening.
Senare ändrades denna metod genom att ersätta de ovan beskrivna proberna med de med en längd på 20 bp, kopplade till endast en fluorofor och komplementära i tandem till en mRNA-sekvens av intresse, vilket betyder att de kollektivt skulle binda till det riktade mRNA:t. En sådan sond i sig skulle inte producera en stark signal, men den kumulativa fluorescensen hos de samlade sonderna skulle visa en ljuspunkt. Eftersom enstaka felbundna sonder sannolikt inte kommer att samlokaliseras, är falskt positiva signaler i denna metod begränsade.
Således upptäcker denna in situ hybridisering (ISH) teknik rumslig lokalisering av RNA-uttryck via direkt avbildning av individuella RNA-molekyler i enstaka celler.
RNAscope
En annan in situ hybridiseringsteknik som kallas RNAscope använder sönder av den specifika Z-formade designen för att samtidigt förstärka hybridiseringssignaler och undertrycka bakgrundsbrus. Det möjliggör visualisering av enstaka RNA i en mängd olika cellulära typer. De flesta steg i RNAscope liknar det klassiska ISH-protokollet. Vävnadsprovet fixeras på objektglas och behandlas sedan med RNAscope-reagenser som tränger igenom cellerna. Z-prober är utformade på ett sätt att de endast är effektiva när de är bundna i par till målsekvensen. Detta gör att ett annat element i denna metod (förförstärkare) kan anslutas till Z-sondernas övre ändar. När den väl är fäst, fungerar förförstärkaren som ett bindningsställe för andra element: förstärkare som i sin tur binder till en annan typ av sönder: märkningssonder. Som ett resultat bildas en skrymmande struktur på målsekvensen. Viktigast av allt, förförstärkaren misslyckas med att binda till en singulär Z-sond, så ospecifik bindning skulle inte medföra signalemission, vilket eliminerar bakgrundsbrus som nämndes i början.
seqFISH
Sekventiell fluorescens i s itu - hybridisering (seqFISH) är en annan metod som ger identifiering av mRNA direkt i enstaka celler med bevarande av deras rumsliga sammanhang . Denna metod utförs i flera omgångar; var och en av dem inkluderar fluorescerande probhybridisering, avbildning och konsekutiv probstrippning. Olika gener tilldelas olika färger i varje omgång, vilket genererar en unik temporal streckkod. Således särskiljer seqFISH mRNA genom en sekventiell färgkod, såsom röd-röd-grön. Ändå har denna teknik sina brister med autofluorescerande bakgrund och höga kostnader på grund av antalet prober som används i varje omgång.
MERFISH
Konventionella FISH-metoder är begränsade med en låg mängd gener som kan analyseras samtidigt på grund av det lilla antalet distinkta färgkanaler, så multiplexerad felrobust FISH designades för att övervinna detta problem. M ultiplexed E rror -R obust FISH (MERFISH) ökar avsevärt antalet RNA-arter som samtidigt kan avbildas i enstaka celler med användning av binär kodgenmärkning i flera omgångar av hybridisering. Detta tillvägagångssätt kan mäta 140 RNA-arter åt gången med hjälp av ett kodningsschema som både upptäcker och korrigerar fel. Kärnprincipen ligger i identifiering av gener genom att kombinera signaler från flera på varandra följande hybridiseringsomgångar och tilldela N-bitars binära streckkoder till gener av intresse. Koden beror på specifika prober och omfattar "1" eller "0" värden och deras kombination är inställd på olika sätt för varje gen. Fel undviks genom att använda sexbitars eller längre koder där två av dem skiljer sig åt med minst 3 bitar. En specifik sond skapas för varje RNA-art. Varje sond är en målspecifik oligonukleotid som består av 20-30 baspar och som komplementärt binder till mRNA-sekvensen efter att ha trängt igenom cellen. Sedan utförs flera omgångar av hybridisering enligt följande: för varje omgång läggs endast en sond som inkluderar "1" i motsvarande binära kodposition. I slutet av varje omgång används fluorescerande mikroskopi för att lokalisera varje sond. Förväntat skulle endast de mRNA som hade "1" i den tilldelade positionen fångas. Foton fotoblektas sedan och en ny delmängd läggs till. Således hämtar vi en kombination av binära värden som gör det möjligt att skilja mellan många RNA-arter.
smHCR
Enkelmolekyl - RNA-detektion på djupet genom hybridiseringskedjareaktion (smHCR) är en avancerad seqFISH-teknik som kan övervinna typiska komplikationer av autofluorescerande bakgrund i tjocka och ogenomskinliga vävnadsprover . I denna metod binds flera avläsningssonder med målregionen för mRNA. Mål detekteras av en uppsättning korta DNA-sonder som fäster till det i definierad undersekvens. Varje DNA-sond bär en initiator för samma HCR-förstärkare. Sedan penetrerar fluoroformärkta DNA HCR-hårnålar provet och sätts samman till fluorescerande amplifieringspolymerer som fäster på initierande prober. I multiplexade studier används samma tvåstegsprotokoll som beskrivs ovan: alla sonduppsättningar introduceras samtidigt, precis som alla HCR-förstärkare; spektralt distinkta fluoroforer används för ytterligare avbildning.
osmFISH
Cyclic- o uroboros smFISH (osmFISH) är en anpassning av smFISH som syftar till att övervinna utmaningen med optisk trängsel. I osmFISH visualiseras transkript, och en bild förvärvas innan sonden strippas och ett nytt transkript visualiseras med en annan fluorescerande sond. Efter på varandra följande omgångar sammanställs bilderna för att se den rumsliga fördelningen av RNA:t. På grund av att transkriptioner visualiseras sekventiellt eliminerar det problemet med signaler som stör varandra. Denna metod tillåter användaren att generera högupplösta bilder av större vävnadssnitt än andra relaterade tekniker.
ExFISH
Expansion FISH (ExFISH) utnyttjar expansionsmikroskopi för att möjliggöra superupplösningsavbildning av RNA-lokalisering, även i tjocka prover som hjärnvävnad. Den stöder både enkelmolekylära och multiplexade avläsningar.
EASI-FISH
Expansionsassisterad iterativ fluorescens in situ -hybridisering (EASI-FISH) optimerar och bygger på ExFISH med förbättrad detektionsnoggrannhet och robust multi-round bearbetning över prover tjockare (300 μm) än vad som tidigare var möjligt. Den innehåller också en nyckelfärdig pipeline för beräkningsanalys.
seqFISH+
SeqFISH+ löste optiska problem relaterade till rumslig trängsel genom efterföljande omgångar av fluorescens. Först hybridiserar en primär sond till riktat mRNA och sedan binder efterföljande prober till flankerande regioner av den primära sonden, vilket resulterar i en unik streckkod. Varje avläsningssond fångas som en bild och komprimeras till en superupplöst bild. Denna metod tillåter användaren att rikta in sig på upp till tio tusen gener åt gången.
DNA-mikroskopi
DNA-mikroskopi är en distinkt avbildningsmetod för optikfri kartläggning av molekylers positioner med samtidig bevarande av sekvenseringsdata utförda i flera på varandra följande in situ- reaktioner. Först fixeras celler och cDNA syntetiseras. Randomiserade nukleotider taggar sedan mål-cDNA in situ , vilket ger unika märkningar för varje molekyl. Taggade transkript amplifieras i den andra in situ -reaktionen, hämtade kopior sammanfogas och nya randomiserade nukleotider läggs till. Varje konsekutiva sammankopplingshändelse är märkt, vilket ger unika händelseidentifierare. Algoritmen genererar sedan bilder av de ursprungliga transkripten baserat på avkodade molekylära närheter från de erhållna sammanlänkade sekvenserna, medan målets singelnukleotidinformation också registreras.
in situ sekvensering
ISS använder hänglåssonder
ISS hänglåsmetoden är baserad på hänglåssondering, rolling-circle amplification (RCA) och sekvensering genom ligationskemi. Inom intakta vävnadssektioner transkriberas mRNA omvänt till cDNA, vilket följs av mRNA-nedbrytning av RNase H. Sedan finns det två sätt på hur denna metod kan utföras. Det första sättet, gap-inriktad sekvensering, involverar hänglåssond som binder till cDNA med ett gap mellan ändarna av sonden som är inriktade för sekvensering genom ligering. DNA-polymerisation fyller sedan denna lucka och en DNA-cirkel skapas genom DNA-ligering. Ett annat sätt, streckkodsinriktad sekvensering, utförs DNA-cirkularisering av en hänglåsprob med en streckkodssekvens endast genom ligering. I båda versionerna av metoden ligeras ändarna och bildar en cirkel av DNA. Målförstärkning utförs sedan med RCA, vilket ger mikrometerstora RCA-produkter (RCP). RCA består av upprepningar av hänglåsets sondsekvens. Dessa DNA-molekyler utsätts sedan för sekvensering genom ligering, avkodning av antingen en gap-fylld sekvens eller en upp till fyra baser lång streckkod i sonden med intilliggande ändar, beroende på version. No-gap-variant hävdar högre känslighet, medan gap-filled en innebär att man läser ut den faktiska RNA-sekvensen av transkriptet. Senare förbättrades denna metod genom automatisering på en mikrofluidisk plattform och substitution av sekvensering genom ligering med sekvensering genom hybridiseringsteknologi.
FISSEQ
Fluorescerande in situ sekvensering (FISSEQ), liksom ISS hänglås, är en metod som använder omvänd transkription, rullande cirkelförstärkning och sekvensering genom ligeringstekniker. Det möjliggör rumslig transkriptomanalys i fixerade celler. RNA omvänt transkriberas först till cDNA med vanliga och modifierade aminbaser och taggade slumpmässiga hexamer RT-primrar. Aminbaser medierar tvärbindningen av cDNA till dess cellulära omgivning. Sedan cirkuleras cDNA genom ligering och amplifieras med RCA. Enkelsträngade DNA-nanobollar med 200–400 nm i diameter erhålls som ett resultat. Således omfattar dessa nanobollar ett flertal tandemupprepningar av cDNA-sekvensen. Därefter utförs sekvensering via SOLiD-sekvensering genom ligering. Positioner av både produkt av omvänd transkription och klonalt amplifierade RCP:er upprätthålls via tvärbindning till cellulära matriskomponenter som nämnts tidigare, vilket skapar ett 3D in situ RNA-seq-bibliotek i cellen. När de väl är bundna med fluorescerande prober med olika färger, blir amplikoner mycket fluorescerande vilket möjliggör visuell detektering av signalen; bildbehandlingsalgoritmen förlitar sig dock på läsjustering till referenssekvenser snarare än signalintensitet.
Barista-seq
Streckkod i s itu . riktad sekvensering (Barista-seq) är en förbättring av gap-hänglås-probmetodologin som har en femfaldig ökning av effektiviteten, en ökad läslängd på femton baser och är kompatibel med illumina - sekvenseringsplattformar Metoden använder också hänglåssonder och rullande cirkelförstärkning, men detta tillvägagångssätt använder sekvensering-för-syntes och tvärbindning till skillnad från gap-hänglåsmetoden. Tvärbindningen till den cellulära matrisen i samma procedur är densamma som FISSEQ.
STARmap
Spatialt upplöst transkript en mplicon r eadout map ping (STARmap) använder en hänglåsprob med en extra primer som möjliggör direkt amplifiering av mRNA, utan behovet av omvänd transkription . I likhet med andra hänglås-probbaserade metoder sker amplifiering via rullande cirkelförstärkning. DNA-amplikonerna är kemiskt modifierade och inbäddade i en polymeriserad hydrogel i cellen. Infångat RNA kan sedan sekvenseras in situ tillhandahållande av tredimensionella placeringar av mRNA i varje cell.
fångst på plats
Rumslig transkriptomik
Spatial Transcriptomics är förmågan att fånga det positionella sammanhanget för transkriptionsaktivitet i intakt vävnad, antingen för regioner eller enstaka celler.
När en vävnadskryosektion är fäst vid ett rumsligt transkriptomiskt objektglas binder streckkodade primers och fångar intilliggande mRNA från vävnaden. Medan vävnadssektionen är fäst vid objektglaset, initieras omvänd transkription av infångat mRNA och det resulterande cDNA:t inkorporerar den rumsliga streckkoden för primern. Efter infångning av mRNA och omvänd transkription prepareras sekvenseringsbibliotek och analyseras med Illumina-färgämnessekvensering . Den rumsliga streckkoden som finns i varje genererad sekvens gör att data för varje enskilt mRNA-transkript kan kartläggas tillbaka till dess ursprungspunkt i vävnadssektionen.
NanoString GeoMx
NanoStrings GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) låter användaren definiera ett mikroskopiskt område av intresse på ett FFPE eller fruset vävnadsobjektglas på grund av en UV-fotoklyvbar streckkod som är konstruerad i in-situ hybridiseringssonderna. Området av intresse är specifikt exponerat för UV-ljus, streckkoderna klyvs och används för att identifiera RNA eller protein som finns i vävnaden. De definierade regionerna av intresse kan variera i storlek mellan tio och sexhundra mikrometer, vilket möjliggör målinriktning av en mängd olika strukturer och celler i det histologiska provet.
Slide-seq
Slide-seq förlitar sig på att RNA-bindande, DNA-streckkodade mikropärlor fästs på ett gummibelagt glastäckglas. Mikropärlorna mappas till sin rumsliga plats via SOLiD-sekvensering. Vävnadssnitt överförs till detta täckglas för att fånga extraherat RNA. Infångat RNA amplifieras och sekvenseras. Transkriptlokalisering bestäms av streckkodens oligonukleotidsekvens från kulan som fångade den.
APEX-seq
APEX-seq möjliggör bedömning av det rumsliga transkriptomet i olika regioner av en cell. Metoden använder APEX2-genen, uttryckt i levande celler som inkuberas med biotin-fenol och väteperoxid. Under dessa förhållanden katalyserar APEX2-enzymerna överföringen av biotingrupper till RNA-molekylerna och dessa kan sedan renas via streptavidinpärlor. De renade transkripten sekvenseras sedan för att bestämma vilka molekyler som fanns i omedelbar närhet av biotinmärkningsenzym.
HDST
High - Definition Spatial Transcriptomics (HDST) börjar med att avkoda platsen för mRNA -infångningskulor i brunnar på ett objektglas . Detta åstadkoms genom sekventiell hybridisering till streckkodsoligonukleotidsekvensen för varje kula. När platsen för varje kula är avkodad kan ett vävnadsprov placeras på objektglaset och permeabiliseras. De fångade transkripten sekvenseras sedan. HDST använder mindre pärlor än Slide-seq och kan således lösas upp med en rumslig upplösning på två mikrometer jämfört med tio mikrometer av Slide-seq.
10X Visium
10X Visium-analysen är en nyare och förbättrad version av Spatial Transcriptomics-analysen. Den använder också fläckiga arrayer av mRNA-fångande prober på ytan av objektglas men med ökat antal fläckar, minimerad fläckstorlek och ökad mängd infångningssonder per fläck. Inom vart och ett av de fyra infångningsområdena på Visium Spatial Gene Expression-objektglasen finns det cirka 5000 streckkodade fläckar, som i sin tur innehåller miljontals rumsligt streckkodade infångningsoligonukleotider. Vävnads-mRNA frisätts vid permeabilisering och binder till de streckkodade oligonerna, vilket möjliggör infångning av genuttrycksinformation. Varje streckkodad fläck är 55 µm i diameter, och avståndet från mitten av en fläck till mitten av en annan är cirka 100 µm. Fläckarna är förskjutna för att minimera avståndet mellan dem. I genomsnitt fångas mRNA från någonstans mellan 1 och 10 celler per fläck vilket ger nästan encellsupplösning.
i kiselkonstruktion
Rekonstruktion med ISH
in silico Spatial Reconstruction med ISH innebär beräkningsmässig rumslig rekonstruktion av cellers lägen enligt deras uttrycksprofiler. Det finns flera liknande metoder för denna princip. De samanalyserar encellig transkriptomik och tillgängliga ISH-baserade genuttrycksatlaser av samma celltyp. Baserat på dessa data tilldelas celler sedan till sina positioner i vävnaden. Uppenbarligen är denna metod begränsad av faktorn för tillgängligheten av ISH-referenser. Dessutom blir det mer komplicerat när man tilldelar celler i komplexa vävnader. Detta tillvägagångssätt är inte tillämpligt för kliniska prover på grund av bristen på parade referenser. Rapporterad framgångsfrekvens för den exakta allokeringen av celler i hjärnvävnad var 81 %.
DistMap
Kartläggning av transkriptomet med hjälp av Distmap-algoritmen kräver enkelcellssekvensering med hög genomströmning och en existerande in situ hybridiseringsatlas för vävnaden av intresse. Distmap-algoritmen genererar en virtuell 3D-modell av vävnaden av intresse med användning av transkriptomerna från sekvenserade celler och nämnda referensatlas. Transkriptomerna kan klustras i celltyper med hjälp av t-fördelad stokastisk granninbäddning och mappas till 3D-modellen med hjälp av virtuell in situ hybridisering. I huvudsak tar denna algoritm data som genereras från enstaka celler i en dissocierad vävnad och kan kartlägga individuella transkript till var celltypen finns i vävnaden med hjälp av virtuell in situ hybridisering.
Historia
in situ hybridisering utvecklades i slutet av 60-talet och såg stora utvecklingar på 80-talet (smFISH) och 10-talet (RNAscope, seqFISH, MERFISH och osmFISH) med de senaste tilläggen seqFISH+ och DNA-mikroskopi. Mikrodisektionstekniker utvecklades först i slutet av 90-talet (Laser Capture Microdissection) och det senaste tillskottet var 2016 med utvecklingen av ProximID. Spatial genomics/transcriptomics som teknik uppfanns och utvecklades 2000 av Michael Doyle (av Eolas ), Maurice Pescitelli (från University of Illinois i Chicago ), Betsey Williams (av Harvard ) och George Michaels (från George Mason University ), som en del av Visible Embryo Project Det utökades senare 2016 av Jonas Frisén, Joakim Lundeberg, Patrik Ståhl och deras kollegor i Stockholm . Under 2019 vid Broad Institute utvecklade Fei Chen och Evan Macoskos labb Slide-seq, som använde streckkodade oligor på pärlor.
Se även
Fluorescens in situ hybridisering