Expansionsmikroskopi
Expansionsmikroskopi (ExM) är ett provberedningsverktyg för biologiska prover som gör det möjligt för utredare att identifiera små strukturer genom att expandera dem med hjälp av ett polymersystem . Förutsättningen är att introducera ett polymernätverk i cell- eller vävnadsprover och sedan fysiskt expandera det polymernätverket med hjälp av kemiska reaktioner för att öka storleken på de biologiska strukturerna. Bland andra fördelar tillåter ExM att dessa små strukturer kan avbildas med ett bredare utbud av mikroskopitekniker. Det föreslogs först i en artikel från 2015 av Fei Chen, Paul W. Tillberg och Edward Boyden . Aktuell forskning möjliggör expansion av prover upp till 16 gånger större än deras ursprungliga storlek. Denna teknik har visat sig användbar i olika laboratoriemiljöer, till exempel vid analys av biologiska molekyler. ExM tillåter forskare att använda standardutrustning för att identifiera små strukturer, men kräver att man följer procedurer för att säkerställa tydliga resultat.
Principer
Syfte
Traditionell ljusmikroskopi har gränser för upplösning som hindrar den från att tillförlitligt särskilja små strukturer som är viktiga för biologisk funktion, och måste istället avbildas med en högre upplösningsteknik, såsom elektronmikroskopi . Till exempel synaptiska vesiklar 40-50 nanometer i diameter, vilket är under den allmänt citerade upplösningsgränsen på 200 nanometer för ljusmikroskopi. Expansionsmikroskopi löser detta problem genom att expandera det underliggande vävnadsprovet. En viktig fördel med prover framställda med hjälp av expansionsmikroskopi och ljusmikroskopi jämfört med konventionell elektronmikroskopi är att det också gör det möjligt för utredare att färga för och visualisera specifika molekyler i provet, såsom specifika proteiner eller RNA för att identifiera deras densitet och distribution i förhållande till den biologiska strukturer av intresse. Den mest fördelaktiga principen för expansionsmikroskopi är att den inte kräver någon specialiserad utrustning; materialen för expansion är värda lite eller ingenting jämfört med priset för ett mikroskop som skulle kunna få samma upplösning.
Etapper
Expansionsmikroskopi är en flerstegsprocess som, beroende på protokoll, har olika krav på gelning och expansion. Sekvensen av steg är färgning, länk, smälta och expandera. Färgningsprocessen kan ta många olika former och kräver bara att de fluoroforer som används kan fästa på polymeren i nästa steg. Länkning är processen att tillsätta en polymergel till cellerna, som permeabiliserar genom cellen. Länkningssteget inkluderar också, som namnet antyder, processen att länka fluoroforerna till gelén. Matsmältningssteget innebär att man lägger till en lösning som smälter cellen och tar bort strukturen från cellen. Om detta steg misslyckas kommer gelén inte att expandera jämnt eftersom cellen kommer att försöka hålla ihop. Misslyckande med detta steg kan också orsaka sprickbildning eller frakturer i cellen. Slutligen gör expansionen att gelén fysiskt expanderar i alla riktningar, vilket gör att fluoroforerna som är fästa vid gelén expanderar också.
Historia
År 2015 beskrev Chen, Tillberg och Boyden, alla i MIT först expansionsmikroskopi som en metod för att förbättra mikroskopiupplösningen genom att svälla ett prov istället för att använda utrustning med högre upplösning. Sedan dess har användningen av ExM fortsatt att växa. Teknikens nyhet gör att få applikationer har utvecklats. Den vanligaste användningen är i biologiska prover.
Under 2016 publicerades flera artiklar som beskriver lösningar för ExM:s traditionella begränsning av märkningssonder. Dessa förändringar föreslog ett sätt att använda ExM med konventionella mikroskopisonder, vilket möjliggör bredare användning. Under 2016 tillämpades dessa nya märkningsmetoder för att möjliggöra fluorescensmikroskopi av RNA-molekyler, vilket i sin tur ledde till rumsligt exakt in situ-sekvensering, nämligen ExSeq (expansionssekvensering), 2021.
Även med expansionsmikroskopi kan Alzheimers sjukdomsrelaterade amyloid -beta-plack inte lösas. Boyden utarbetade "expansionsavslöjande mikroskopi" 2022, och lade till fluorescerande markörer efter expansion istället för tidigare. Han ersatte enzymer med värme. Detta möjliggjorde en upp till 20-faldig expansion, utan att skada proteiner. Det har använts för att avslöja synapsdetaljer och för att belysa Alzheimers sjukdom och avslöja enstaka spiraler av amyloid-beta-protein runt axoner , som är de trådlika delarna av nervceller som bär elektriska impulser.
Teori
Expansionsmikroskopi uppnås genom att syntetisera ett polymersystem i ett prov. Genom att sedan svälla detta polymernätverk expanderas provet för att undersökas under konventionella mikroskopiska analysverktyg utan att försämra provets integritet. Detta gör att ett prov kan analyseras med ett mindre kraftfullt mikroskop än vad som skulle behövas utan expansion, och gör analys av mikroskopiska biologiska prov mer tillgänglig för laboratorier som annars inte skulle ha varit tillgängliga för att ha råd med eller erhålla nödvändig kraftfull mikroskopiteknik.
Ansökningar
Använda sig av
Expansionsmikroskopi är en metod som förbättrar den slutliga bildupplösningen under vanlig mikroskopi genom att fysiskt förstora själva organismen, vävnaden eller molekylen. Efter förstoringen av organismen, vävnaden eller molekylen kan fler standardmikroskop uppnå högre upplösningsavbildning med mindre fysiologiska egenskaper. De primära områden som denna metod används inom är de som är involverade i att analysera biologiska prover med tillägg av immunfärgande eller fluorescerande färgämnen. Fluorescerande etiketter appliceras efter expansionsmikroskopi för att göra synliga täta kluster av proteiner och molekyler. Denna teknik har dock sedan dess använts inom många olika forskningsområden och fortsätter att växa och tillämpas i fler och fler laboratoriemiljöer.
Sjukdomar och diagnoser
Innan upptäckten av expansionsmikroskopi gjordes undersökning av cellulära strukturer och biomolekyler med användning av diffraktionsbegränsad mikroskopi. De användes huvudsakligen för att diagnostisera eller undersöka patogenesen av en mängd olika predisease och sjukdomstillstånd. Men biomolekyler är i nanoskala i dimension och är lokaliserade med nanoskala precision i celler och vävnader. Flera tekniker som superupplösningsmikroskopi användes, men dessa krävde komplex hårdvara och var svåra att applicera på mänskliga vävnader. Sålunda utvecklades expansionsmikroskopi. Denna metod förstorade fysiskt vävnadsproverna snarare än optiskt, och kunde som ett resultat producera bilder med hög upplösning. Dessa högkvalitativa bilder av vävnader fungerade som en vändpunkt i diagnostisk och medicinsk expansionsmikroskopi.
Liksom många andra tekniker har expansionsmikroskopi också många potentialer inom det medicinska och diagnostiska området. Expansionsmikroskopi förbättrar upplösningen av ljusmikroskopi genom att fysiskt expandera proverna. När denna teknik tillämpas på de kliniska vävnadsprover nanoskala avbildning av mänskliga vävnadsprover. För det första används expansionspatologi för att omvandla kliniska prover till ett kompatibelt tillstånd för expansionsmikroskopin. Denna process kan användas för optisk diagnos av njursjukdom med minimal förändring , tidiga bröstneoplastiska lesioner och för att upptäcka skillnaden mellan normala mänskliga vävnadsprover och cancervävnadsprover, vilket möjliggör rutinmässig användning av klinisk forskning. Användningen av patogen expansionsmikroskopi möjliggjorde tydliga bilder av vävnad. Tillämpning av expansionsmikroskopi på mikroarrayer som innehåller prover från olika organ, såsom bröst, prostata, lunga, tjocktarm, bukspottkörtel, njure, lever och äggstockar, inklusive normala och cancerinnehållande vävnader, möjliggjorde diagnostik och undersökning av cellulära nätverk av sjukdomstillstånd vävnader. Denna avbildning avslöjar sub-diffraktionsgränsstorleksegenskaper hos de mellanliggande filamenten keratin och vimentin , kritiska i epitelial mesenkymal övergång, cancerprogression och initiering av metastaser.
I framtiden, efter ytterligare utveckling av denna teknik, förväntas observation av nanoskala morfologi av biomolekyler och prover från ett stort antal mänskliga organ tillhandahållas.
Neurovetenskap
Många av frågorna kring neurovetenskap försöker svara på och förstå molekyler och ledningar i neurala kretsar . Det är dock svårt att kartlägga dessa strukturer över de stora skalorna av neurala kretsar. I dessa fall förstorar ExM biologiska prover såsom hjärnkretsar och gör att de lättare kan kartläggas. Biomolekyler , såsom proteiner och nukleinsyror, är förankrade till polymeren, som sedan svälls för att expandera biomolekylerna. På grund av det ökade avståndet mellan biomolekylerna kan vanliga mikroskop sedan utföra nanoskala upplösningsavbildning. Genom att använda ExM-teknik kan neuroforskare lättare kartlägga bilder av synapser, celler och neurala kretsar.
Delmängder
Med utvecklingen av expansionsmikroskopi har forskare börjat skapa delmängder av tekniken, inklusive scanning Joule expansionsmikroskopi, eller SJEM. SJEM använder en termisk avbildningsteknik som mäter den termiska expansionen av Joule-uppvärmda element. En av de största fördelarna med SJEM jämfört med äldre submikron värmeavbildningstekniker är att SJEM inte kräver nanotillverkning av specialiserade prober. SJEM kräver snarare bara ett standard atomkraftmikroskop och enkel elektronik.
Fördelar
En av de viktigaste fördelarna med expansionsmikroskopi jämfört med andra former av mikroskopi är att det inte krävs en starkare optisk utrustning för att utföra högupplöst bildbehandling. Eftersom ExM förstorar det fysiska provet, befriar det forskare från behovet av att köpa en dyr mikroskopiutrustning som elektronmikroskop för superupplösningsstudier. Genom att expandera provet blir det lättare att undersöka då de större strukturerna sedan kan undersökas med traditionella mikroskopitekniker, såsom ljusmikroskopi.
Begränsningar
Vart och ett av de fyra beredningsstegen i ExM måste slutföras helt, annars kommer cellen inte att ge en ljus och klar fläck. Underlåtenhet att slutföra dessa steg kan resultera i att cellen går sönder eller ojämn expansion, vilket förvränger bilden bortom användning. ExM kämpar i de procedurer som använder fluoroformarkörer , eftersom polymerisationsprocessen kan bleka dessa fluoroforer, vilket gör dem oanvändbara. Det finns några, såsom Alexa 488 och Atto 565 som fortfarande är effektiva efter polymerisation, men deras effektivitet minskar kraftigt till cirka 50%. Konjugeringen av DNA med en annan antikropp är ofta mycket kostsam och svår. Dessa två problem är de primära begränsningarna för att använda ExM i biologiska prover. Det är viktigt att notera att även om återbindning av nya antikroppar kan vara kostsamt och tidskrävande, är det ibland möjligt, efter expansion, i de fall antikroppen kämpar för att binda i tät vävnad. Efter expansion är vävnaden mycket mindre tät och möjliggör ofta bättre mottagning av fluorescerande antikroppar.