Restriktionssmältning

En restriktionsdigerering är en procedur som används inom molekylärbiologi för att förbereda DNA för analys eller annan bearbetning. Det kallas ibland för DNA-fragmentering (denna term används också för andra procedurer). Hartl och Jones beskriver det så här:

Denna enzymatiska teknik kan användas för att klyva DNA-molekyler på specifika ställen, vilket säkerställer att alla DNA-fragment som innehåller en viss sekvens på en viss plats har samma storlek; vidare har varje fragment som innehåller den önskade sekvensen sekvensen belägen på exakt samma position i fragmentet. Klyvningsmetoden använder sig av en viktig klass av DNA-klyvande enzymer isolerade främst från bakterier. Dessa enzymer kallas restriktionsendonukleaser eller restriktionsenzymer, och de kan klyva DNA-molekyler vid de positioner där särskilda korta sekvenser av baser är närvarande.

Det resulterande digererade DNA:t amplifieras mycket ofta selektivt med polymeraskedjereaktion (PCR), vilket gör det mer lämpligt för analytiska tekniker såsom agarosgelelektrofores och kromatografi . Det används vid genetisk fingeravtryck , plasmidsubkloning och RFLP - analys .

Restriktionsplats

Ett givet restriktionsenzym skär DNA-segment inom en specifik nukleotidsekvens , vid vad som kallas ett restriktionsställe . Dessa igenkänningssekvenser är typiskt fyra, sex, åtta, tio eller tolv nukleotider långa och generellt palindromiska (dvs samma nukleotidsekvens i 5'-3'-riktningen). Eftersom det bara finns så många sätt att ordna de fyra nukleotiderna som utgör DNA (adenin, tymin, guanin och cytosin) till en sekvens på fyra till tolv nukleotider, tenderar igenkänningssekvenser att inträffa av en slump i vilken lång sekvens som helst. Restriktionsenzymer som är specifika för hundratals distinkta sekvenser har identifierats och syntetiserats för försäljning till laboratorier, och som ett resultat uppträder flera potentiella "restriktionsställen" i nästan vilken gen eller plats som helst av intresse på vilken kromosom som helst. Dessutom inkluderar nästan alla artificiella plasmider en (ofta helt syntetisk) polylinker (även kallad "multipelkloningsställe") som innehåller dussintals restriktionsenzymigenkänningssekvenser inom ett mycket kort DNA-segment. Detta möjliggör införande av nästan vilket specifikt fragment av DNA som helst i plasmidvektorer , som effektivt kan "klonas" genom insättning i replikerande bakterieceller.

Efter restriktionsdigerering kan DNA sedan analyseras med hjälp av agarosgelelektrofores . Vid gelelektrofores "laddas" först ett DNA-prov på en platta av agarosgel (bokstavligen pipetterad i små brunnar i ena änden av plattan). Gelén utsätts sedan för ett elektriskt fält, som drar det negativt laddade DNA:t över sig. Molekylerna färdas med olika hastighet (och hamnar därför på olika avstånd) beroende på deras nettoladdning (mer högladdade partiklar färdas längre) och storlek (mindre partiklar färdas längre). Eftersom ingen av de fyra nukleotidbaserna bär någon laddning, blir nettoladdningen obetydlig och storleken är den huvudsakliga faktorn som påverkar diffusionshastigheten genom gelén. Nettoladdningen i DNA produceras av sockerfosfatryggraden . Detta i motsats till proteiner, där det inte finns någon "ryggrad", och nettoladdningen genereras av olika kombinationer och antal laddade aminosyror .

Möjliga användningsområden

Restriktionsdigerering används oftast som en del av processen för molekylär kloning av DNA-fragment till en vektor (såsom en kloningsvektor eller en expressionsvektor ). Vektorn innehåller typiskt ett multipelt kloningsställe där många restriktionsställen kan hittas, och en främmande del av DNA kan infogas i vektorn genom att först skära restriktionsställena i vektorn såväl som DNA-fragmentet, följt av ligering av DNA-fragmentet in i vektorn.

Restriktionssammanslutningar är också nödvändiga för att utföra någon av följande analytiska tekniker:

• RFLP – Restriction fragment length polymorphism
• AFLP – Amplifierad fragmentlängdspolymorfism
• STRP – Kort tandem upprepad polymorfism

Olika restriktionsenzymer

Det finns många typer av restriktionsenzymer, som var och en skär DNA på olika sätt. De mest använda restriktionsenzymer är typ II restriktionsendonukleas (se artikel om restriktionsenzymer för exempel). Det finns några som klipper en sekvens med tre baspar medan andra kan klippa fyra, sex och till och med åtta. Varje enzym har distinkta egenskaper som avgör hur effektivt det kan skära och under vilka förhållanden. De flesta tillverkare som producerar sådana enzymer kommer ofta att tillhandahålla en specifik buffertlösning som innehåller den unika blandningen av katjoner och andra komponenter som hjälper enzymet att skära så effektivt som möjligt. Olika restriktionsenzymer kan också ha olika optimala temperaturer under vilka de fungerar.

Observera att för effektiv digerering av DNA bör restriktionsstället inte vara beläget i slutet av ett DNA-fragment. Restriktionsenzymerna kan kräva ett minsta antal baspar mellan restriktionsstället och änden av DNA:t för att enzymet ska fungera effektivt. Detta antal kan variera mellan enzymer, men för de mest använda restriktionsenzymer är cirka 6–10 baspar tillräckligt.

Se även

• Agarosgelelektrofores
• DNA-sekvensering
• Genetisk fingeravtryck
• PCR
• Restriktionsfragmentlängdpolymorfism

externa länkar

• New England Biolabs – Producent av restriktionsenzymer. Den här webbplatsen innehåller mycket detaljerad information om många enzymer, deras optimala temperaturer och igenkänningssekvenser.
• REBAS