RNas H-beroende PCR
RNas H-beroende PCR (rhPCR) är en modifiering av standard PCR- tekniken. I rhPCR är primrarna utformade med ett borttagbart amplifieringsblock på 3'-änden. Amplifiering av den blockerade primern är beroende av klyvningsaktiviteten hos ett hypertermofilt arkealt Typ II RNas H -enzym under hybridisering till den komplementära målsekvensen. Detta RNas H-enzym har flera användbara egenskaper som förbättrar PCR. För det första har den mycket liten enzymatisk aktivitet vid låg temperatur, vilket möjliggör en " varmstart PCR " utan modifieringar av DNA-polymeraset . För det andra reduceras enzymets klyvningseffektivitet i närvaro av felparningar nära RNA-resten. Detta möjliggör minskad primerdimerbildning , detektion av alternativa splitsningsvarianter , förmåga att utföra multiplex PCR med högre antal PCR-primrar och förmågan att detektera enkelnukleotidpolymorfismer .
Princip
rhPCR- primrar består av tre sektioner. 1) 5'-DNA-sektionen, motsvarande krav på längd och smälttemperatur (Tm) med en standard PCR-primer, förlängs efter klyvning av RNase HII-enzymet. 2) En enda RNA-bas tillhandahåller klyvningsstället för RNas HII. 3) En kort 3'-förlängning av fyra eller fem baser följt av en blockerare (vanligtvis en kort, icke-förlängningsbar molekyl som en propandiol ) förhindrar förlängning av ett DNA-polymeras tills det avlägsnas. En rhPCR-reaktion börjar med primrarna och mallen fria i lösning (Figur 1). Medan de är fria i lösning avblockeras dessa primrar inte av RNase HII-enzymet, eftersom de måste vara i ett RNA:DNA-heteroduplex med mallen som ska klyvas. När rhPCR-primrarna väl är bundna till mallen klyvs de av det termostabila RNase HII-enzymet. Detta tar bort blocket, vilket gör att DNA-polymeraset kan sträcka sig bort från primrarna. Cyklingen av PCR-reaktionen fortsätter processen. rhPCR-primrar är utformade så att efter klyvning av RNase H2-enzymet är Tm för primrarna fortfarande högre än hybridiseringstemperaturen för PCR-reaktionen. Dessa primrar kan användas i både 5'-nukleas Taqman och SYBR Green typer av kvantitativ PCR .
Ansökningar
rhPCR kan användas för kvantitativ PCR och medicinska eller miljömässiga laboratorier: