Molekylär ledstjärna
Molecular beacons , eller molekylära beacon-prober , är oligonukleotidhybridiseringsprober som kan rapportera närvaron av specifika nukleinsyror i homogena lösningar . Molekylära beacons är hårnålsformade molekyler med en internt släckt fluorofor vars fluorescens återställs när de binder till en målnukleinsyrasekvens. Detta är en ny icke- radioaktiv metod för att detektera specifika sekvenser av nukleinsyror. De är användbara i situationer där det antingen inte är möjligt eller önskvärt att isolera prob-målhybriderna från ett överskott av hybridiseringssonderna.
Molekylära beacon-sonder
En typisk molekylär beacon-sond är 25 nukleotider lång. [ Citat behövs ] De mellersta 15 nukleotiderna är komplementära till mål- DNA eller RNA och baspar inte med varandra, medan de fem nukleotiderna vid varje ände är komplementära till varandra snarare än till mål-DNA. En typisk molekylär beaconstruktur kan delas upp i 4 delar: 1) loop, en 18–30 basparsregion av den molekylära beaconen som är komplementär till målsekvensen; 2) stam bildad av bindningen till båda ändar av slingan av två korta (5 till 7 nukleotidrester) oligonukleotider som är komplementära till varandra; 3) 5'-fluorofor vid 5'-änden av den molekylära beaconen, ett fluorescerande färgämne är kovalent fäst; 4) 3' quencher (icke fluorescerande) färgämne som är kovalent fäst vid 3'-änden av den molekylära beaconen. När fyren är i form av en sluten slinga, befinner sig släckaren i närheten av fluoroforen, vilket resulterar i att den fluorescerande emissionen av den senare dämpas.
Om nukleinsyran som ska detekteras är komplementär till strängen i slingan, inträffar händelsen av hybridisering . Den duplex som bildas mellan nukleinsyran och slingan är mer stabil än den hos stammen eftersom den tidigare duplexen involverar fler baspar. Detta orsakar separation av stammen och därmed av fluoroforen och släckaren. När fluoroforen inte längre är bredvid släckaren, resulterar belysning av hybriden med ljus i fluorescerande emission. Närvaron av emissionen rapporterar att händelsen av hybridisering har inträffat och att målnukleinsyrasekvensen därför finns i testprovet.
Används inom cellteknik
Fluorogena signaloligonukleotidsonder rapporterades för användning för att detektera och isolera celler som uttrycker en eller flera önskade gener, inklusive produktion av multigenstabila cellinjer som uttrycker heteromultimer epitelial natriumkanal (αβγ-ENaC), natriumspänningsstyrd jonkanal 1.7 (NaV1.7) -αβ1β2), fyra unika γ-aminosmörsyra A (GABAA) receptor jonkanal underenhetskombinationer α1β3γ2s, α2β3γ2s, α3β3γ2s och α5β3γ2s, cystisk fibros konduktansregulator (CFTRs) (CFTRs), 50 CFTR-proteiner (CFTRs-receptorer)
Syntes
Molekylära beacons är syntetiska oligonukleotider vars framställning är väl dokumenterad. Förutom den konventionella uppsättningen av nukleosidfosforamiditer , kräver syntesen också ett fast underlag derivatiserat med en quencher och en fosforamiditbyggsten utformad för att fästa ett skyddat fluorescerande färgämne.
Den första användningen av termen molekylära beacons, syntes och demonstration av funktion var 1996.
Alternativa homogena analystekniker
- 5'-nukleas TaqMan-analys
- Exciton-kontrollerade hybridiseringskänsliga fluorescerande oligonukleotidsonder (ECHO).
- Dubbla hybridiseringssonder (LightCycler®).
- Scorpions® sonder
- LUX (Light Upon Extension) sonder
- DNA-bindande färgämnen (t.ex. SYBR Green, SYTO9, Melt Doctor, LCGreen Plus, etc.)
Ansökningar
- SNP-detektering
- Nukleinsyradetektering i realtid
- PCR-kvantifiering i realtid
- Allelisk diskriminering och identifiering
- Multiplex PCR-analyser
- Diagnostiska kliniska analyser