Kromosomhoppning
Kromosomhoppning är ett verktyg för molekylärbiologi som används vid fysisk kartläggning av genom . Det är relaterat till flera andra verktyg som används för samma ändamål, inklusive kromosomvandring .
Kromosomhoppning används för att kringgå områden som är svåra att klona , till exempel de som innehåller repetitivt DNA , som inte enkelt kan kartläggas genom kromosomvandring, och är användbart för att snabbt förflytta sig längs en kromosom på jakt efter en viss gen . Till skillnad från kromosomvandring kan kromosomhoppning börja på en punkt av kromosomen för att korsa potentiella avlägsna punkt på samma kromosom utan att klona de mellanliggande sekvenserna. Ändarna av ett stort DNA-fragment är målkloningsdelen av kromosomhoppningen medan mittsektionen tas bort genom sekvenser av kemiska manipulationer före kloningssteget.
Bearbeta
Kromosomhoppning gör att två ändar av en DNA-sekvens kan klonas utan mittsektionen. Genomiskt DNA kan partiellt spjälkas med användning av restriktionsendonukleas och med hjälp av DNA-ligas cirkuleras fragmenten i låg koncentration. Från en känd sekvens utformas en primer för att sekvensera över den cirkulära förbindelsen. Denna primer används för att hoppa 100 kb -300 kb intervaller: en sekvens 100 kb bort skulle ha kommit nära den kända sekvensen vid cirkularisering, den tillåter hopp och sekvensering på ett alternativt sätt. Således kan sekvenser som inte kan nås genom kromosomvandring sekvenseras. Kromosomvandring kan också användas från den nya hopppositionen (i endera riktningen) för att leta efter genliknande sekvenser, eller ytterligare hopp kan användas för att gå vidare längs kromosomen. Genom att kombinera kromosomhoppning till kromosom som går genom kromosomen kan man kringgå repetitivt DNA för att söka efter målgenen.
Bibliotek
Kromosomhoppningsbibliotek skiljer sig från kromosomvandring på grund av de manipulationer som utfördes före kloningssteget . För att konstruera biblioteket av kromosomhoppning, bör individuella kloner härröra från slumpmässiga punkter i genomet (allmänna hoppbibliotekens första grundläggande protokoll) eller från ändarna av specifika restriktionsfragment (specifika hoppbiblioteks alternativa protokoll) identifieras.
NotI-smält DNA
Ett exempel för att bygga ett bibliotek är ett klassificerat som ett sällsynt skärande restriktionsendonukleas såsom NotI. För att konstruera och karakterisera ett bibliotek baserat från NotI-digererat humant DNA, analyserades slumpmässiga kloner genom restriktionskartläggning . På grund av den breda fördelningen av fragmentstorlekar som gjordes av den fullständiga digereringen med NotI, konstruerades biblioteket i två fraktioner, låg och hög plasmidkoncentration. Kloner som hade unika ändfragment analyserades sedan genom hybridisering till pulsfältsgradient ( PFG) Southern blöts . Genom att undersöka resultaten som samlats in för enkel- och dubbelklyvning av humant DNA med enzymerna NotI, BssHII och NruI skapades en restriktionskarta med 850 kb-regionen innehållande de länkande och hoppande klonerna. Vidare var Notl-fragment av 250 och 350 kb hopp uppenbara i de två ändklonerna härledda motsvarande genetiska avstånd på 0,25 och 0,35 cM.
Fördelar och nackdelar
Fördelarna med kromosomhoppning är:
- Tillåter snabbare rörelse genom genomet jämfört med andra tekniker, såsom kromosomvandring .
- Kan resa över kromosomala regioner som innehåller icke-klonbara sekvenser i bakterievärdar.
- För det tredje kan denna teknik användas för att generera genomiska markörer med kända kromosomala platser.
- Kombination av hoppning och länkning av hoppbibliotek till promenader ger möjlighet till riktningsgång och kan möjliggöra analys av längre regioner i parallella kartläggningsstrategier.
- Minskar komplexiteten hos bibliotek som ska screenas och konstrueras av däggdjursgenom .
Trots dessa fördelar är emellertid kromosomhoppning fortfarande begränsad av kapaciteten hos kloningsvektorn, vilket är avståndet mellan ändarna av de två fragmenten, vilket kan vara ungefär hundratals kilobaser. Dessutom, eftersom hoppet inte klonar det mellanliggande DNA:t, skulle kromosomvandring behöva göras för att identifiera alla gener som finns i DNA:t. Oavsett vilket bedöms det fortfarande vara fördelaktigt på grund av möjligheten att hoppa över hundra kilobaser i jämförelse med kromosomvandring.
Ansökningar
Genetiska störningar
Kromosomhoppningsbibliotek hjälper till att hantera komplikationen av vanliga kloningstekniker med stora molekylära avstånd. Denna process gjorde det möjligt att använda kromosomhoppningsbiblioteket för andra genetiska störningar som kräver 100 kilobaser. Särskilt för genetiska störningar som cystisk fibros , dess gen är lokaliserad i mänsklig kromosom 7 , kunde använda kromosomhoppningsbiblioteket för att söka efter en hoppande klon, träffade onkogen. Identifiering av cystisk fibros var komplicerad på grund av att den existerade i eukaryota gener som är sammansatt av kodande (exoner) och icke-kodande (introner) segment, där introner är små i storlek vilket gör dem svåra att upptäcka. En annan kamp för att känna igen cystisk fibros-genen är att däggdjursceller innehåller en mängd olika repetitiva DNA som kan leda till felaktig kloning och blockering av DNA-replikation och kan orsaka instabilitet. Båda dessa komplikationer, traditionella kloningstekniker är oförmögna att bearbeta eftersom stora utbyten av exoner skulle behöva vara synliga för att producera en signal för att genen för cystisk fibros ska identifieras och DNA skulle behöva vara fritt från repetitiva element.