Oligomerrestriktion
Oligomer Restriction (förkortat OR ) är en procedur för att detektera en förändrad DNA- sekvens i ett genom . En märkt oligonukleotidsond hybridiseras till ett mål - DNA och behandlas sedan med ett restriktionsenzym . Om sonden exakt matchar målet kommer restriktionsenzymet att klyva sonden och ändra dess storlek. Om emellertid mål-DNA:t inte exakt matchar proben, kommer restriktionsenzymet inte att ha någon effekt på probens längd. OR-tekniken, som nu sällan utförs, var nära förknippad med utvecklingen av den populära polymeraskedjereaktionsmetoden ( PCR).
Exempel
I del 1a av schemat visas oligonukleotidproben, märkt på dess vänstra ände (asterisk), på den översta raden. Det är helt komplementärt till dess mål-DNA (här taget från den humana β-hemoglobingenen ), som visas på nästa rad. En del av sonden inkluderar igenkänningsstället för restriktionsenzymet Dde I (understruket).
I del 1b har restriktionsenzymet klyvt proben och dess mål (Dde I lämnar tre baser oparade i varje ände). Den märkta änden av sonden är nu bara 8 baser lång och separeras lätt med gelelektrofores från den oklippta sonden, som var 40 baser lång.
I del 2 visas samma sond hybridiserad till ett mål-DNA som inkluderar en enkelbasmutation (här mutationen som är ansvarig för Sickle Cell Anemia , eller SCA). Den felmatchade hybriden fungerar inte längre som ett igenkänningsställe för restriktionsenzymet, och sonden förblir vid sin ursprungliga längd.
Historia
Oligomer Restriction-tekniken utvecklades som en variant av RFLP-analysmetoden ( Restriction Fragment Length Polymorphism ), med hopp om att undvika det mödosamma Southern blotting- steget som används i RFLP-analys. OR skapades av Randall Saiki och Henry Erlich i början av 1980-talet, som arbetade på Cetus Corporation i Emeryville, Kalifornien . Det patenterades 1984 och publicerades 1985, efter att ha applicerats på den genomiska mutationen som är ansvarig för sicklecellanemi . OR ersattes snart av den mer allmänna tekniken med allelspecifika oligonukleotidsonder (ASO).
Problem
Metoden för oligomerrestriktion var behäftad med ett antal problem:
- Det kunde endast tillämpas på den lilla uppsättningen av DNA-polymorfismer som förändrar ett restriktionsställe, och endast på de ställen för vilka sekvensinformation var känd. Många av de kända RFLP-analyserna detekterade polymorfismer som var långt borta från deras sondplatser.
- Det är svårt att märka oligonukleotider till en nivå som är tillräckligt hög för att använda dem som prober för genomiskt DNA. Detta problem plågade också utvecklingen av ASO-sonder.
- Det är svårt att designa oligonukleotider och använda dem på ett sätt så att de blir hybridiseringsprober för bara ett enda ställe i ett genom. Bindning till icke-specifika platser kan ofta skymma effekten av sonden på målplatsen.
- Inte alla restriktionsenzymer har den önskade specificiteten för sin igenkänningssekvens. Vissa kan känna igen och skära enkelsträngat DNA, och vissa visar en låg nivå av klyvning för felmatchade ställen. Även en liten mängd ospecifik klyvning kan översvämma den svaga signalen som förväntas från målsekvensen.
- Det var svårt att utforma en OR-metod som inkluderade kontroller för båda allelerna som testades. I del 2 av det förenklade exemplet som beskrivs ovan, klyvdes inte sonden när den hybridiserades till ett mutant mål. Men samma (icke-) resultat skulle inträffa för det stora överskottet av ohybridiserad prob, såväl som om något problem uppstod som förhindrade fullständig nedbrytning av restriktionsenzym. I den faktiska rapporterade metoden användes ett andra icke-polymorft restriktionsställe för att skära hela den hybridiserade sonden, och en andra omärkt oligonukleotid användes för att "blockera" den ohybridiserade sonden. Dessa kontroller skulle inte ha varit tillgängliga för andra mål.
Förhållande till PCR
Trots sina begränsningar gynnades OR-tekniken av dess nära samband med utvecklingen av polymeraskedjereaktionen. Kary Mullis , som också arbetade på Cetus, hade syntetiserat oligonukleotidsonderna som testades av Saiki och Erlich. Medveten om problemen de stötte på, föreställde han sig en alternativ metod för att analysera SCA-mutationen som skulle använda komponenter från Sanger DNA-sekvenseringsteknik . Han insåg svårigheten att hybridisera en oligonukleotidprimer till en enda plats i genomet och övervägde att använda en andra primer på den motsatta strängen. - segmentet mellan primrarna - en replikationskedjereaktion katalyserad av DNA -polymeras .
När Mullis stötte på sina egna svårigheter med att demonstrera PCR , gick han med i en befintlig grupp av forskare som tog upp problemen med OR. Tillsammans utvecklade de den kombinerade PCR-OR-analysen. Således blev OR den första metoden som användes för att analysera PCR-förstärkt genomiskt DNA.
Mullis stötte också på svårigheter med att publicera grundidén om PCR (vetenskapliga tidskrifter publicerar sällan koncept utan åtföljande resultat). När hans manuskript för tidskriften Nature förkastades lades den grundläggande beskrivningen av PCR skyndsamt till den tidning som ursprungligen var avsedd att rapportera OR-metoden (Mullis var också medförfattare där). Detta OR-papper blev därmed den första publiceringen av PCR, och skulle under flera år bli den rapport som andra forskare citerade mest.